ELISA方法的及步骤.doc

1、 香港生科仪有限公司BiosciEquip Supply International Co.，Limited _ _ 北京办事处 北京市海淀区吴家场路 1 号唐宁府 4 号楼 1 单元 404 室 邮编 100036 . 电话及传真: 010-63955306; 13661397601; email: ; Web： 一、ELISA 方法的及步骤：ELISA 是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自 70 年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学

2、科学的许多领域。 (一) 原理 ELISA 是以免疫学反应为基础，将抗原、牽 9 体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图 a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图 b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是 ELISA 双抗体夹心法及 ELISA 间接法。 (二) 操作步骤 方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹

3、心法: 1. 包被：用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 110g ml 。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗 3 次，每次 3 分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中，置 37孵育 1 小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml 。37孵育0.51 小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1ml，371030 分

4、钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测 OD 值：在 ELISA 检测仪上，于450nm(若以 ABTS 显色，则 410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔 OD 值，若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍，即为阳性。 方法二 用于检测未知抗体的间接法： 用包被缓冲液将已知抗原稀释至 110gml， 每孔加 0.1ml，4过夜。次日洗涤 3 次。 加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml 于上述已包被之

5、反应孔 中,置 37孵育 1 小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照 ) 香港生科仪有限公司BiosciEquip Supply International Co.，Limited _ _ 北京办事处 北京市海淀区吴家场路 1 号唐宁府 4 号楼 1 单元 404 室 邮编 100036 . 电话及传真: 010-63955306; 13661397601; email: ; Web： 于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体 )0.1ml， 37孵育 30-60 分钟，洗涤,最后一遍用 DDW 洗涤。 其余步骤同“双抗体夹心法”的 4、5、6。 (三) 试剂器材 1. 试剂 (1)

6、 包被缓冲液(PH9.6 0.05M 碳酸盐缓冲液): NaCO 1.59 克 NaHCO 2.93 克 加蒸馏水至 1000ml (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2 克 Na2HPO12H2O 2.9 克 NaCl 8.0 克 KCl 0.2 克 Tween-20 0.05 0.5ml 加蒸馏水至 1000ml (3) 稀释液： 牛血清白蛋白(BSA) 0.1 克 加洗涤缓冲液至 100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成 510使用。 (4) 终止液(2M H SO）： 蒸馏水 178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98)21.7ml。 (5) 底物

7、缓冲液(PH5.0 磷酸棗柠檬酸 ): 0.2M NaHPO(28.4 克L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2 克L) 24.3ml 香港生科仪有限公司BiosciEquip Supply International Co.，Limited _ _ 北京办事处 北京市海淀区吴家场路 1 号唐宁府 4 号楼 1 单元 404 室 邮编 100036 . 电话及传真: 010-63955306; 13661397601; email: ; Web： 加蒸馏水 50ml。 (6) TMB(四甲基联苯胺)使用液: TMB(10mg5ml 无水乙醇 ) 0.5ml 底物缓冲液(PH5.5) 1

8、0ml 0.75HO 32l (7) ABTS 使用液: ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3HO 2l (8) 抗原、抗体和酶标记抗体。 (9) 正常人血清和阳性对照血清。 2. 器材: (1) 聚苯乙烯塑料板( 简称酶标板 )40 孔或 96 孔，ELISA 检测仪，50l 及 100l加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。 (2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。 (3) 4冰箱，37孵育箱。 (四) 注意事项 1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血

9、清或 BSA 等封闭。 2. 在 ELISA 中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括 : (1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是 40 孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。 （2) 包被抗体(或抗原) 的选择：将抗体 (或抗原) 吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH 在 9.09.6 之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用 41824 小时。

10、蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0 和 10gml 等) 进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的 OD 值。选择 OD 值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为110gml。 香港生科仪有限公司BiosciEquip Supply International Co.，Limited _ _ 北京办事处 北京市海淀区吴家场路 1 号唐宁府 4 号楼 1 单元 404 室 邮编 100036 . 电话及传真: 010-63955306; 13661397601; email: ; Web： (3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接 ELIS

11、A 法进行初步效价的滴定( 见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。 (4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如 OPD 等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB 和 ABTS 是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以 10-30 分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是 H2O2 在临用前加入。 生物谷网站 http:/ 二、

12、ELISA 原理与分类ELISA 的原理ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或 抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，

13、间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。2. ELISA 的类型ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即“免疫吸附剂“（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物“（conjugate ）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的 ELISA 主要有以下几种类型：2.2.1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂

14、质。2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般

15、选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成“夹心复合物“。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见 1.3.2，图 1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假

16、阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中 HBsAg、AFP 和尿液 hCG 等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的 a 决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在 HBsAg 的检测中应注意亚型问题，HBsAg 有香港生科仪有限公司BiosciEquip Supply International Co.，Limited _ _ 北京办事处 北京市海淀区吴家场路 1 号唐宁府 4 号楼 1 单元 404 室 邮编 100036

17、. 电话及传真: 010-63955306; 13661397601; email: ; Web： adr、 adw、ayr、ayw4 个亚型，虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。 RF 是一种自身抗体，多为 IgM 型，能和多种动物 IgG 的 Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有 RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用 F（ab）或 Fab 片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc 段，从而消除 RF 的干扰。双抗体夹心法 ELISA 试剂是

18、否受 RF 的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见 6.2）。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。2.2.2 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。2.2.3 间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗

19、体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图 2-3）。操作步骤如下：1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人 Ig 以检测总抗体，但一般多用酶标抗人 IgG 检测 IgG 抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行

20、传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以 E.Coli 为工程酶的重组抗原，如其中含有 E.Coli 成份，很可能与受过 E.Coli 感染者血甭中的抗 E.Coli 抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人 Ig 反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的 Ig 去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。间接法中另一

21、种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性 IgG 只占总IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异 IgG 可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:401:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 2.2.4 竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固

22、相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗 HBc ELISA 一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗 HBe 的检测一般采用此法。香港生科仪有限公司BiosciEquip Supply International Co.，Limi

23、ted _ _ 北京办事处 北京市海淀区吴家场路 1 号唐宁府 4 号楼 1 单元 404 室 邮编 100036 . 电话及传真: 010-63955306; 13661397601; email: ; Web： 2.2.5 竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等 ELISA 测定多用此法。2.2.6 捕获包被法测抗体IgM 抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法 ELI

24、SA 一般仅适用于检测总抗体或 IgG 抗体。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM 抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的 IgG 抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份 IgM 抗体不能结合到固相上。因此如用抗人 IgM 作为二抗，间接测定 IgM 抗体，必须先将标本用 A 蛋白或抗 IgG 抗体处理，以除去 IgG 的干扰。在临床检验中测定抗体 IgM 时多采用捕获包被法。先用抗人 IgM 抗体包被固相，以捕获血清标本中的 IgM（其中包括针对抗原的特异性 IgM 抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性 IgM 相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即

25、与标本中的 IgM 成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式见图 2-7。类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定 IgM 抗体，导致假阳性反应。因此中和 IgG 的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗 CMV IgGM 和抗弓形虫 IgM 抗体已获成功。2.2.7 ABS-ELISA 法ABS 为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量 60000，每个分子由4 个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量 244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的

26、大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与 4 个生物素分子结合，因此如把 ABS 与 ELISA 法可分为酶标记亲和素- 生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原 ELISA 系统中的酶标抗体（抗原）。在 LAB 中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于 ELISA 中可使本底增高。从链霉菌中提取

27、的链霉亲和素则无此缺点，在 ELISA 应用中有替代前者的趋势。由于 ABS-ELISA 较普通 ELISA 多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中 ABS-ELISA 应用不多。需要相关抗体试剂的可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎：http:/ 全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台，由探生科技建立并维护。需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询：http:/