adtau外泌体磷酸化检测艾尔兹海默症神经退行性疾病.ppt

1、目录,阿尔兹海默症 病因临床表现检查诊断治疗方法外泌体Tau蛋白及其磷酸化,阿尔茨海默病（AD）,别称:早老性痴呆，老年性痴呆，老年前期痴呆英文名称:Alzheimer disease， AD就诊科室:神经内科多发群体:70岁以上阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。,病因,该病可能是一组异质性疾病，在多种因素（包括生物和社会心理因素）的作用下才发病。从目前研究来看，该病的可能因素和假

2、说多达30余种，如家族史、女性、头部外伤、低教育水平、甲状腺病、母育龄过高或过低、病毒感染等。,与AD有关的遗传学位点，目前已知的至少有以下4个：早发型AD基因座分别位于2l、14、1号染色体。相应的可能致病基因为APP、S182和STM-2基因。迟发型AD基因座位于19号染色体，可能致病基因为载脂蛋白E（APOE）基因。,临床表现,该病起病缓慢或隐匿，病人及家人常说不清何时起病。多见于70岁以上（男性平均73岁，女性为75岁）老人，少数病人在躯体疾病、骨折或精神受到刺激后症状迅速明朗化。女性较男性多（女男为31）。主要表现为认知功能下降、精神症状和行为障碍、日常生活能力的逐渐下降。根据认知能

3、力和身体机能的恶化程度分成三个时期。,检查,脑脊液淀粉样蛋白、Tau蛋白检测,脑脊液淀粉样蛋白、Tau蛋白检测：AD患者的脑脊液中淀粉样蛋白（A42）水平下降（由于A42在脑内沉积，使得脑脊液中A42含量减少），总Tau蛋白或磷酸化Tau蛋白升高。研究显示，A42诊断的灵敏度86%，特异性90%；总Tau蛋白诊断的灵敏度81%，特异性90%；磷酸化Tau蛋白诊断的灵敏度80%和特异性92%；A42和总Tau蛋白联合诊断AD与对照比较的灵敏度可达85%94%，特异性为83%100%。这些标记物可用于支持AD诊断，但鉴别AD与其他痴呆诊断时特异性低（39%90%）。目前尚缺乏统一的检测和样本处理方

4、法。,治疗,一般治疗AD患者常伴有躯体疾病，而且病程中又可出现新的认知功能障损害和精神症状，涉及到精神科、神经科、内科各学科等多学科治疗。应细致、定期地观察病人，对有明显幻觉、妄想等危险行为者，应及时住院治疗，对生活不能自理的晚期病人应建议注相关医院，同时应向其家属普及安全和护理知识。应限制外出或陪伴外出。饮食中补充富含卵磷脂、维生素A、维生素E、锌、硒等微量元素的事物，限制铝的摄入等,药物治疗1、神经递质有关的药物1）胆碱能药物：乙酰胆碱为促进学习记忆的神经递质。胆碱酯酶抑制剂：通常只适用轻、中度AD无患者，因此其疗效依赖于胆碱神经元的完整程度。2）非胆碱能药物：老年脑功能衰退的原因还与其他

5、神经递质如去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、-氨基丁酸、神经肽等的失衡有关。此类药物有司来吉兰、利诺吡啶等。2、脑细胞代谢激活剂3、脑血循环促进剂4、钙离子拮抗剂：在含有神经元纤维缠结的脑细胞核来源于AD病人的成纤维细胞，均可见得钙的堆积。5、神经营养因子6、抗氧化剂：虾青素、辅酶Q10、维生素E、花青素、叶黄素、司来吉林等7、雌激素：其作用机理尚不清楚8、中医,帕金森综合征对比,帕金森叠加综合征的表现类似帕金森，但程度重，病变广，对左旋多巴治疗反应不佳，包括多系统萎缩（MSA）、进行性核上麻痹（PSP）和皮质基底节变性（CBD）、路易体痴呆（DLB）等。继发性帕金森综合征多是由药物、感染、中

6、毒、脑卒中、外伤等明确病因所致。用于治疗精神疾病的神经安定剂（吩噻嗪类和丁酰苯类）是最常见的致病药物。遗传性帕金森综合征可见于肝豆状核变性、Fahr病、多巴反应性肌张力障碍（DRD）等。,帕金森综合征最常见的病因是原发性帕金森病，该病因黑质纹状体变性、脑内多巴胺含量显著减少所致，对左旋多巴治疗有效，约占帕金森综合征的80%。,二、Tau蛋白与阿尔兹海默症,Tau蛋白介绍阿尔茨海默病（AD）的TAU 变化tau蛋白病理性-外泌体作用项目、专利、文献：分析循环外泌体中的蛋白，开发阿尔茨海默症血液测试;Tau/P-Tau蛋白实验技术路线,1、Tau蛋白介绍,促进微管装配和稳定,可能参与神经细胞极性的

7、建立和维护。糖基结合轴索的微管,而N-端结合神经质膜组件,这表明Tau蛋白作为一个链接器之间的蛋白质。轴突的极性是预定的Tau / MAPT定位(神经细胞)的域定义的细胞中心体。短亚型允许可塑性的细胞骨架，而更长的亚型可能优先在稳定中发挥作用,Microtubule-associated protein tau（微管相关蛋白MAPs） 神经原纤维缠结蛋白；螺旋形细丝蛋白（PHF-Tau）,Tau蛋白磷酸化,tau 蛋白是一种微管相关蛋白 (microtubule associated proteins, MAPs)， 主要存在于轴突内 ，由位于 17 号染色体长臂(17q)的 tau 蛋白基因

8、编码， 长度在 100 kb 以上， 有 16 个外显子， 其中 11 个编码 tau蛋白。,现在已发现 21 个异常过度磷酸化位点， 主要位于 N-末端(Ser198Thr217)和 C-末端(Ser396Ser422)至微管结合重复区。目前研究较多的有 6 个磷酸化位点， 分别为 Thr181、 Ser199/202、 Ser202/Thr205、 Thr231、 Ser262/356 和 Ser396/404。,tau蛋白分子包括 6 种含有 34 个微管结合重复区的变异体， 分别由 352、 381、 383、 410、 412 和 441 个氨基酸残基组成， 分子量为 4867 kD

9、a， 是同一基因不同 mRNA剪接的产物，主要区别在于 C-末端有 3 或 4 个微管结合区及 N-末端的插入序列数目(02 个)。,AD患者脑中可出现 3 种 tau 蛋白 ： 易溶型非磷酸化 tau 蛋白(C-Tau)、 易溶型磷酸化 tau 蛋白 (P-Tau)和双股螺旋丝(pairedhelical filaments, PHFs)聚合 tau 蛋白 (PHF-Tau)， 它们可能代表神经原纤维退化过程的不同阶段3。 研究结果证实， 海马、 内嗅区回路的轴突内 PHF-Tau的数量决定了痴呆的临床表现和程度，同时也是AD中发生认知和记忆功能障碍的重要原因。,2、阿尔茨海默病的磷酸化,在

10、阿尔茨海默病大脑中的神经元细胞骨架逐步瓦解,取而代之的是缠结的配对螺旋细丝(PHF)和直丝,主要由过度磷酸化形式的TAU (PHF-TAU或AD P-TAU)。,O-GlcNAcylation大大减少在阿尔茨海默病大脑大脑皮层增加TAU / MAPT磷酸化,tau 蛋白参与下的淀粉样蛋白级联假说,Tau 蛋白与微管蛋白结合促进其聚合形成微管，其高度可溶，主要存在轴突中与微管结合。在与 tau 蛋白相关的疾病中，其主要病理改变为 tau 蛋白磷酸化而致使不能与微管结合，从而造成轴突转运障碍。AD 的主要病理特点之一也是脑内神经元磷酸化 tau 蛋白高度聚集。针对 tau 蛋白的研究显示其可能为

11、AD 治疗的另一关键点。tau 蛋白的磷酸化又涉及到一系列激酶如CDK5、 钙调蛋白酶、 GSK3等的激活， 设计针对这些激酶的药物是治疗 AD的途径之一。,磷酸化 tau 蛋白与阿尔茨海默病病理过程,从 A到 tau 蛋白，阿尔茨海默病的治疗方式在探索中前进，针对 tau 蛋白的免疫治疗前景广阔。 大量免疫学研究显示在动物试验中降低磷酸化 tau 是可行的，且可以改善认知功能。一些 tau 蛋白相关疫苗也正处于前期临床阶段，很快也将进入临床试验。,病理性tau蛋白的积累是阿尔茨海默病的一个重要特点。 在疾病的早期Tau蛋白从内嗅皮质向海马区域传播。大脑中的吞噬细胞小胶质细胞与tau蛋白的病理

12、相关，但他们在tau蛋白聚集中的作用仍是未知的。,Asai, H., et al. (2015). Nat Neurosci 18(11): 1584-1593. IF=16Budnik, V., et al. (2016). Nat Rev Neurosci 17(3): 160-172. IF=31,3、tau蛋白病理性-外泌体作用,来自波士顿大学的研究者们开发了一种腺相关病毒为基础的模型，tau蛋白可在4周内从内嗅皮层快速聚集至齿状回。研究发现，去除小胶质细胞可显著抑制tau的聚集，并且在该小鼠模型齿状回中降低兴奋性。 此外，研究证明，小胶质细胞通过分泌外泌体的方式传播tau蛋白，并且在

13、体外和体内抑制外泌体合成可显著降低tau蛋白聚集。,这些数据表明，小胶质细胞和外泌体促进了tau蛋白病的发展，该外泌体分泌途径可能是一个潜在的治疗靶标。,研究项目：分析循环外泌体中的蛋白，开发阿尔茨海默症血液测试研究者：加州大学医学和免疫学教授Edward Goetzl,阿尔茨海默症（AD）是一种进程性的神经退行性疾病，俗称为老年痴呆症。目前医生们主要通过临床症状、大脑成像和脑脊液提取来诊断阿尔茨海默症。虽然这些诊断往往是正确的，但只有尸检才能证实疾病标志的存在：大脑中的淀粉样蛋白斑块和tau错误折叠形成的神经纤维缠结。源自神经元的外泌体含有细胞特异性的蛋白质和RNA。如果可以通过循环外泌体追

14、踪异常的淀粉样蛋白和tau蛋白，那么定期血检就可以用来监控阿尔茨海默症患者的疾病进程。,Goetzl及其同事收集了阿尔茨海默症患者确诊前后的血样。他们先用System Biosciences公司的ExoQuick分离血样中的所有外泌体，再用结合神经元表面蛋白的抗体富集神经元外泌体，检测这些外泌体所含的蛋白质。研究显示，在阿尔茨海默症患者的神经元外泌体中，tau、磷酸化tau和淀粉样蛋白的表达水平显著较高。举例来说，阿尔茨海默症神经元外泌体的磷酸化tau比对照多十倍。,现在还不清楚血液中神经元外泌体的总量是否会随着疾病状态发生改变，因此我们应该适当处理数据，在单个外泌体水平上进行分析。此外，蛋白

15、质从外泌体提取出来之后需要迅速分析，“外泌体把蛋白质保护得很好，一旦我们将蛋白质提取出来，它们就很容易降解，”Goetzl指出。,2013年Goetzl与人合作建立了NanoSomiX公司，以开发阿尔茨海默症血液测试。他说：“我们希望能够提前10-15年鉴定到疾病风险，让高风险人群使用预防性药物，”,时间：2016年4月14日,诊断率AD：96.4% 诊断率FTD：87.5%,结论: 神经组织分泌于血液的外泌体中，P-S396-tau、P-T181-tau和A42水平，在临床发病前10年的诊断阿尔茨海默症（AD）,研究背景,Exosomal Tau,CTE的许多临床特征在普通人群中很常见，在没

16、有历史的情况下头部撞击暴露，使临床诊断困难。正如现在常见的其他神经退行性疾病，如阿尔茨海默病，需要通过客观生物标志物来诊断生命中的CTE。,慢性创伤性脑部病变是慢性创伤性脑病(CTE)是一个tauopathy与之前暴露于重复的影响,如发生碰撞通过美式足球和其他运动。诊断是通过神经病理检查进行的。,Journal of Alzheimers Disease 51 (2016) 10991109,研究目的：是检查tau-positive在血浆作为一个潜在的CTE生物标志物。方法:受试者78名前国家足球联盟(NFL)球员和16名对照。从血浆中提取EVs。荧光纳米粒子跟踪分析用于测定Evs中tau-p

17、ositive蛋白含量。,结果:NFL组exosomal tau高于对照组(p 0.0001)。Exosomal tau区分敏感性为82%,特异性为100%；阳性预测值100%,阴性预测值53%。在NFL组exosomal tau含量更高，在神经运动测试和Tests of memory中成绩较差为p = 0.0126)，精神运动速度(p = 0.0093)。结论:这些初步的研究结果表明， exosomal tau在血浆中可能是一种准确、非入侵性CTE 生物标志物。,专利,Exosome biomarker,脑脊液,4、Tau/P-Tau蛋白实验技术路线,1、选取神经退行性细胞株2、无外泌体血清培养细胞,1、提取细胞培养液中外泌体2、模式体系以细胞培养液为构建外泌体检测,1、检测Tau蛋白为外泌体膜表面蛋白2、P-Tau检测磷酸化位点（pIMAGO、抗体）3、检测技术：PLA 、磁微粒化学发光，磁微粒流式技术,