GBS核酸检测.ppt

1、GBS核酸检测,GBS概述,GBS概述,B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS)学名无乳链球菌，革兰氏阳性链球菌，正常寄居于阴道和直肠，属于条件致病菌。,在20世纪70年代，GBS已被证实为围产期母婴感染的主要致病菌之一，在围产医学中占有不可忽视的地位。,什么是围产期,国外研究表明 ，不同地区、不同种族的妊娠晚期妇女GBS带菌率约为6.536.0，国内报道的妊娠妇女GBS带菌率为3.5%32.4，新生儿体表带菌率与母体带菌率相似。在一些特殊人群，如肥胖、糖耐量异常、多次妊娠以及性生活活跃的妇女中带菌率较高。,人群GBS带菌率,是指怀孕28 周到产后一周这一分娩前后的重要

2、时期 围产期保健是指产前、产时和产后的一段时间内，对母亲、胎儿和新生儿进行一系列的保健工作，使母亲健康和胎儿、新生儿的成长发育得到很好的保护。,GBS对孕妇的影响,GBS感染是胎膜早破的重要发病因素 GBS对绒毛膜有较强吸附能力和穿透能力，接种2小时内即可吸附于母体组织，继而侵入绒毛膜，通过炎症细胞的吞噬作用及细菌产生的蛋白水解酶的直接侵袭，使胎膜局部张力减低，从而导致胎膜早破 。GBS生殖道感染是导致早产的重要因素 GBS引起泌尿生殖道感染时，会引起磷脂酶A2和前列腺素及细胞因子的释放，刺激子宫收缩导致早产。GBS是造成产褥感染的主要致病菌之一 产褥感染是指分娩时及产褥期生殖道受病原体感染，

3、引起局部和全身的炎性应化。产褥感染发病率为1%7.2%，是产妇死亡的原因之一 。,GBS对新生儿的影响,GBS感染是新生儿感染的主要原因早发型感染 多见于出生后1周内。母婴垂直传播是其主要传播途径。主要临床表现为败血症（80%）、肺炎（7%）、脑膜炎（6%）；若治疗不及时，可引发远期后遗症，如智力发育迟缓、视觉听觉丧失等。,晚发型感染 多发生于出生1周后。 主要为水平传播：可能与院内感染或家庭接触有关。 常呈隐匿性发病，其特征表现为脑膜炎；1/3的晚发型疾病出现脑膜炎，故这些生存下来的新生儿中更易发生神经系统后遗症。,GBS的传播与感染,国内外GBS筛查现状,美国疾病控制中心(CDC) 制定了

4、围产期GBS预防指南,该指南已经获得以下认可：美国妇产科学院美国儿科学会美国护士助产士协会美国家庭医生协会美国微生物学会美国流行病学会美国药理学会,在我国，2011年，中华医学会妇产科学分会产科学组在孕前和孕期保健指南(第1版)中已将B族链球菌筛查作为一个备查项目。,围产期GBS预防指南指出,对所有孕妇于妊娠3537 周进行GBS筛查，结果阳性者进行预防性治疗以下情况应进行预防性治疗 ：本次妊娠有GBS 菌尿上次新生儿GBS 感染史 在妊娠37 周之前分娩 破膜时间超过18小时 分娩体温超过38.0度,GBS的筛查与预防,预防GBS疾病的抗生素使用方案举例:,围产期GBS预防指南指出： GBS

5、阳性患者应用抗生素进行预防性治疗Boyer在1989年研究中指出，产时氨苄青霉素使用超过1小时就可以使得新生儿感染从28%减少到4%。LIN在2001年的研究中表明，与无产时应用抗生素相比，抗生素预防超过2小时的有效率是89%，不足2小时的有效率为71%。,挑战：我妈妈会进行IAP治疗吗？,围产期GBS预防指南,GBS检测方法比较,PCR介绍,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段；可看作生物体外的特殊DNA复制。,什么是PCR,PCR原理,PCR一般由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：DNA变性

6、：（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 。退火 ：（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 延伸：（70-75）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3端5端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍;23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR原理,PCR反应体系,PCR反应体系中的主要试剂有：,PCR扩增仪,PCR温度循环至关重要，PCR扩增仪各参数必须准确。 现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售PCR扩增仪。国外厂家：Bio-Rad，ABI, Roche 国内厂家：杭州

7、朗基 ，杭州博日,PCR反应特点,特异性强：引物与模板DNA特异正确结合 ，碱基配对原则 ，Taq DNA聚合酶忠实性扩增灵敏度高 ：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（g=10-6）水平 简便快速：一般在14 小时完成扩增反应 模板纯度要求低 ：不需要分离病毒/细菌/培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板,1. 每扩增一条DNA链，就切断一个探针2. 每切断一个探针，就产生一个单位荧光信号3. 荧光信号强度与结合探针的DNA分子数成正比,实时荧光PCR技术：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个

8、PCR进程，最后通过扩增曲线对模板进行分析的方法。,GBS核酸检测产品,荧光PCR检测B族链球菌（GBS）,B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法),Taqman 探针实时PCR技术选择B族链球菌基因组特异且无高频SNP位点的序列区域cAMP因子，设计特异性引物和探针内参照系统排除PCR反应过程中可能的假阴性结果UNG酶避免扩增污染物造成的假阳性适用仪器：Roche LightCycler 480，ABI 7500，Bioer Line-Gene K等多色荧光PCR仪,产品特点,规格：20人份/盒有效期：18 以下避光保存6个月试剂：DNA提取液、GBS PCR反应液、GBS阳

9、性对照品，空白对照品标本类型：生殖道/直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本,试剂盒介绍,溶血样本、保妇康栓、皮炎平对检测结果有显著影响，应尽量避免这些样本的检测。 其他常见干扰物质（粘液和脓液）以及常用药物（青霉素G、阿奇霉素、强力霉素及氧氟沙星、聚甲酚磺醛溶液、洁尔阴洗液、黄硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、肛泰软膏、开塞露）均无明显影响。,待测样本在2-8保存不应超过24小时；-18以下保存不超过4天。,标本要求,标本保存,检测流程（ 2 h ）,DNA提取,1mL标本,沉淀+1mL生理盐水,沉淀+ 50L DNA提取液,99-100 加热10min,取上清至1.5mL离心管中保存,13,000 rp

10、m 10 min,13,000 rpm 5 min,13,000 rpm 10 min,标本，GBS阳性对照品，空白对照品均需要提取DNA。,PCR体系配制40 L 体系：35 L PCR反应液 + 5 L DNA模板,PCR扩增程序： 50 2min 95 5min,（ 95 15s,60 35s ）,45 cycles,实时监测PCR扩增过程,FAM 通道 HEX通道,FAM通道检测结果：分析样本，空白对照品： Ct值不显示；阳性对照品： Ct30.00； HEX通道检测结果： 分析内参照基因，Ct35.00,阴性：样品的FAM通道无Ct值显示, HEX通道Ct35.00 阳性： 样品的F

11、AM通道 Ct38.00， HEX通道Ct35.00备注：若样品的FAM通道 38.00Ct45.00，建议重新检测该样本， 若重检结果仍为38.00Ct45.00或Ct38.00，判定为阳性； 若Ct不显示且HEX通道Ct35.00，判定为阴性。,结果有效性判定,结果分析,以上要求需在同一次实验中同时满足,产品优势一,灵敏度高：采用PCR方法检测DNA，试剂与国际领先试剂性能相同 特异性强：不与临床常见其它各类病原体产生交叉反应 稳定性好：样本DNA提取质量高，阳性对照品、空白对照品内参基因扩增曲线高度吻合，试剂稳定 无污染：全封闭PCR体系，避免实验室其它PCR产物污染 易操作：操作简便，采用预制PCR反应液，无需额外加入内参照基因、酶等 速度快：检测周期短，从核酸提取到PCR结束实验过程不到2小时,产品优势二,公司GBS、 UU (解脲脲原体)、NG（淋球菌）、CT（沙眼衣原体）四 个核酸检测试剂盒检测样本类型，DNA提取步骤和PCR扩增程序相同，结果阈值线的设定也相同；四个病原体可以同时依次进行DNA提取、PCR扩增步骤，区别只是所用试剂不同。如果客户四个检测项目全部使用公司产品，会节省时间和工作量，符合客户操作简便的要求。,谢 谢,