藏药翼首草的HPLC指纹图谱研究.DOC

1、藏药翼首草 的 HPLC 指纹图谱研究 张小梅 1,2， 柯秀梅 1， 2， 励娜 2， 王云红 2， 梁旭明 2* （ 1.成都中医药大学 ,成都 611137； 2.重庆市中药研究院 重庆市中药资源重点实验室 ,重庆 400065） 摘要 目的 :建立藏药翼首草的高效液相色谱指纹图谱，并对不同产地翼首草的指纹特征进行比较，为其质量评价提供新的方法。 方法 :采用 HPLC 测定了 10 批不同产地的翼首草样品 。 Boston Symmetrix色谱柱 （ 4.6 mm250 mm,5 m） ， 流动相 甲醇 -0.1molL-1乙酸铵 水 溶 液（ 81:19） ， 流速 0.8 mLm

2、in-1， 检测波长 210 nm，柱温 30 。 并对不同产地样品的相似度进行了比较。 结果 :利用 药典会 指纹图谱相似度评价系统（ 2004A版）建立了 翼首草 药材的指纹图谱共有模式，标出了 11个特征峰。 10批样品的相似度均较高。 结论 :该 方法具有较好的重复性、精密度、稳定性，可为 翼首草 的质量控制提供科学依据。 关键词 ： 藏药 翼首草； 高效液相色谱 ；指纹图谱 中图分类号： R283.1 文献标识码： A 文章编号： HPLC Fingerprint of Tibetan Medicine Pterocephali Herba ZhANG Xiao-mei1,2, KE

3、 Xiu-mei 1,2, LI Na2, WANG Yun-hong2, LIANG Xu-ming2* (1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine（ TCM） , Chengdu 611137, China; 2. Chongqing Academy of Chinese Traditional Materia Medica, Key Laboratory of Chongqing TCM Resources ,Chongqing 400065, China) Abstract Objective: To establish

4、HPLC fingerprint of Tibetan medicine Pterocephali Herba, and compare it of Pterocephali Herba from different place, provided a new methods for its quality evaluation. Method: Adoption the method of HPLC to determine 10 groups of Pterocephali Herba from different place. Chromatographic Column was Bos

5、ton Symmetrix（ 2504.6mm,5m） , mobile phase was Methanol-0.1 molL-1 ammonium acetate solution(81:19),velocity was 收稿日期 20130715（ 010） 基金项目 重庆市卫生局中医药科技项目（ 2010-1-139） ; 中药新产品开发研究能力提升建设 项目（ cstc2012pt-kyys10004） ； 中国药典一部标准研究 项目 （ YS-262） 第一作者 张小梅，博士，副研究员，从事中药新药开发 及物质基础研究工作， Tel： 023-89029025， E-mail：

6、通讯作者 *梁旭明，博士，副研究员，从事中药新药开发及质量标准研究工作， Tel： 023-89029010， E-mail： 0.8mLmin-1, the detection wavelength was 210nm, column temperature was 30 . And compared the similarity of Pterocephali Herba from different place. Result: Taking advantage of to establish common mode of HPLC fingerprint of Tibetan med

7、icine Pterocephali Herba, and marked 101 characteristic peaks. The 10 groups samples had high similarity. Conclusion: This method had good repeatability, precision, and stability, providing scientific basis for quality control of Pterocephali Herba. Key words: Tibetan Medicine Pterocephali Herba; HP

8、LC; Fingerprint 翼首草 具有解毒除瘟，清热止痢，祛风通痹之功效 1-7， 主要成分为齐墩果烷型五环三萜皂苷类化合物，此外还含有生物碱、多糖等化学成分 8。 由于产地多、药材采收混乱，且缺乏相应的质量控制手段，致使市场上的翼首草 药材 质量良莠不齐。 现有 药典 标准和文献多以齐墩果酸和熊果酸为定性和定量指标对该药材 进行质量评价 1， 3， 9-11， 而 这 2种成分并非翼首草独有， 多种 药用植物中也同时含这 2种 成分 ， 故仅以齐墩果酸和熊果酸为定性和定量的标准缺乏专属性 ；另外 有 测定马钱苷 12、马钱子素 13的含量 来控制其质量 ， 但 研究表明皂苷 7， 14

9、为翼首草的 主要药效成分。 尽管有报道分离得到了翼首草皂苷 A， B， C， D，但仍未能对其进行含量测定 15，仅以翼首草皂苷 D为对照品对翼首草进行了薄层鉴别 16，因此，目前 仍然 没 有翼首草药材的 专属性有效成分来 控制其质量。 作者在制订 翼首草药材标准载入 中国药典 2010年版 后， 采用高效液相色谱 /HPLC技术建立了翼首草 药材 的指纹图谱 并对其进行了系统研究 ，测定了 10批不同产地的 翼首草 药材 ，建立了 翼首草 指纹图谱共有模式，为 翼首草 的质量控制 及 科学 评价 ， 提供试验依据 。 1 仪器 与 试药 2695 型 高效液相 色谱仪 （包括 Waters

10、 2996 检测器， Waters Empower 化学工作站 ，美国Waters 公司）， AEG-45SM 型 电子天平（ 1/10 万 ，日本岛津公司）， BP121S 型电子天平 （ 1/万 ， 北京赛多利斯科学仪器有限公司 )。 齐墩果酸 （批号 110709-200505） 、 熊果酸 （批号 110742-200516，纯 度 99.0%） 均由中国 食品 药品检定 研究院提供， 甲醇 为色谱纯 ， 水为超纯 水， 其他 试剂均为分析纯（重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂）。 13 批翼首草 为本院生药研究所研究人员收购或采自四川、西藏等地，采 集时间多为 2008年 7 月 至

11、 8 月，经重庆市中药研究院院长钟国跃研究员鉴定 为川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri (C. B. Clarke) Hoeck 的干燥全草 。 样品来源见表 1。 表 1 翼首草药材来源、产地一览 批号 产地 药用部位 采集时间（月） 购买厂家 1 四川 带根全草 7-8 甘孜州藏医院 2 四川 带根全草 7-8 甘孜州藏医院 3 四川 带根全草 开花期 道孚县 5 甘肃 带根全草 7-8 青海卓玛藏中蒙药材行 7 四川 带根全草 7-8 青海雪域中藏药材 批发部 9 甘肃 带根全草 7-8 青海亚朗中藏药材批发部 10 青海 带根全草 7-8 西宁藏聚堂商贸公

12、司 11 四川 带根全草 7-8 西宁雪源药材有限公司 12 甘肃 带根全草 7-8 青海九康中药销售部 13 四川 带根全草 7-8 西宁九康中药饮片销售中心 2 方法与结果 2.1 色谱条件 Symmetry Shield Rp18 色谱柱 (4.6 mm 250 mm， 5 m)， 流动相 甲醇-0.1molL-1 乙酸铵 水 溶液（ 81:19） ，检测波长 210 nm， 柱温 30 ，流速 0.8 mLmin-1，进样量 20 L， 运行时间 60 min。 2.2 对照品 溶液 的制备 取齐墩果酸和熊果酸对照品适量，精密称定，加入甲醇溶解并制成浓度约为 1 gL-1 的溶液作为对

13、照品溶液。 2.3 供试品溶液的制备 取翼首草粉末（过 五 号筛） 5 g，精密称定，置具塞锥形瓶，加入 乙醚 50 mL，超声处理（功率 250 W，频率 40 Hz） 20 min，冷却，滤 过 ，用少量 乙醚 润洗滤渣，合并滤液，蒸干，残渣加甲醇转移至 5 mL 量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 2.4 方法学考察 2.4.1 精密度试验 取同一批翼首草药材（第二批），按 2.3 项下方法制备供试品溶液，连续进样 6 次，记录指纹图谱。结果 ， 各主要色谱峰 峰面积积分值 和相对保留时间，其 RSD分别为 1.23%2.86%和 0.040.14%， 表明该仪器精密度良好

14、。 2.4.2 稳定性 试验 取同一批翼首草药材 （第二批） ，按 2.3 项下方法制备供试品溶液，分别在 0， 4， 8， 12， 16， 24 h 记录指纹图谱。 结果，各主要色谱峰峰面积积分值和相对保留时间，其 RSD 分别为 1.18%2.09%和 0.15%0.35%，说明样品在 24 h 内稳定 。 2.4.3 重复性试验 取同一批翼首草药材（第二批），按 2.3 项下方法制备供试品溶液，平行操作制备 6 份，分别记录指纹图谱。结果，各主要色谱峰峰面积积分值和相对保留时间，其 RSD 分别为 1.46%2.86%和 0.07%0.11%，说明 重复性良好 。 2.5 翼首草指纹图谱

15、共有模式的建立 取 10 批翼首草样品，分别按 2.3 项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，记录指纹图谱。将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（ 2004A 版）”软件，选择 S12 为参照图谱，通过中位数法自动匹配，生成对照指纹图 谱；并根据匹配结果确定了 11 个共有峰。 齐墩果酸和熊果酸 对照品的 HPLC 图见图 1； 10 批 翼首草 药材的 HPLC 指纹图谱叠加图见图 2；指纹图谱的共有模式见图 3。 t/min 1 齐墩果酸 ； 2.熊果酸 图 1 齐墩果酸和熊果酸 HPLC t/min 图 2 10 批翼首草药材指纹图谱叠加 t/min 图 3 指纹图谱共有模式

16、 2.6 相似度分析 通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（ 2004A 版）”软件得到与共有模式相比较的 10 批样品的相似度， 见表 2。结果表明，不同产地样品的相似度均较高。选择 11 号 峰为内参照峰，分别计算 10 批样品 11 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，其平均值和 RSD见表 3。由表 3 可知，不同产地样品各共有峰相对保留时间的 RSD均 1.39，而相对峰面积的 RSD 却差别较大。 表 2 与共有模式相比较的 10 批样品的相似度 批号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 对照指纹图谱 0.993 0.975 0.995 0.932 0.996 0.991 0

17、.992 0.995 0.993 0.981 表 3 相对保留时间 和峰面积 共有峰 相对保留时间的平均值 相对保留时间的 RSD/% 相对峰面积的平均值 相对峰面积的 RSD/% 1 0.185 0.29 0.171 54.11 2 0.200 0.46 0.066 95.42 3 0.223 1.15 0.093 35.92 4 0.244 0.51 0.011 37.31 5 0.267 1.39 0.061 15.64 6 0.310 0.17 0.109 16.17 7 0.364 0.25 0.103 25.07 8 0.519 0.47 0.140 52.42 9 0.729 0

18、.28 0.045 39.55 10 0.947 0.10 0.317 5.43 11 1.000 0.00 1.000 0.00 3 讨论 3.1 流动相 和色谱柱 的选择 考察了 甲醇 -0.1moLL-1 乙酸铵 水 溶液 、乙腈 -0.1 moLL-1 乙酸铵 水 溶液 、甲醇 -乙腈 -0.1 moLL-1 乙酸铵 水 溶液 、乙腈 -水、乙腈 -0.2%醋酸 水 溶液、乙腈 -0.1%磷酸 水 溶液 等 梯度洗脱； 除了乙腈 -水，乙腈 -磷酸水洗脱时基线较平， 其他 梯度洗脱基线不稳。 熊果酸与齐墩果酸 为翼首草已知有效成分，可以作为参照物，但其结构 互为同分异构体，较难分 离。

19、 仅甲醇和乙腈与乙酸铵溶液 等度 洗脱才能较好地分离，因此分别 考察了 甲醇 、乙腈与 0.1 moLL-1 乙酸铵溶液 等等度洗脱。 色谱柱主要考察了 Boston Symmetrix ODS-R（ 4.6 mm250 mm， 5 m） ， Boston Symmetrix ODS-AQ（ 4.6 mm250 mm， 5 m） ， Waters Nova-Pak C18 WAT086344（ 3.9 mm150 mm， 4 m） ， Welcrom C18（ 4.6 mm250 mm， 5 m） ， Venusil MP C18（ 4.6 mm250 mm， 5 m） ，Ultimate M

20、P C18（ 4.6 mm250 mm， 5 m） ， Boston Luna Clone (4.6 mm250 mm， 5 m)，Phenomenex Gemini C18 110A（ 4.6 mm250 mm， 5 m） ， Inertsil (4.6 mm250 mm， 5 m)等 ， 结果，由于熊果酸与齐墩果酸互为同分异构体，在以上色谱柱的考察中发现较少有色谱柱能很好的分开齐墩果酸和熊果酸，特别是分离度和拖尾因子都能达到要求的较少。采用色谱柱 Boston Symmetrix ODS-R（ 4.6 mm250 mm， 5 m） ，流动相 甲醇 -0.1 moLL-1 乙酸铵溶液（ 81

21、： 19）所测成分齐墩果酸和熊果酸的分离度、拖尾因子及分析时间能得到满意的结果。但翼首草中 大多 成分 不明确 ，本文选择齐墩果酸和熊果酸为参照物，需选择能有效的分开齐墩果酸和熊果酸的流动相和色谱柱。 因此 选择 色谱柱 Boston Symmetrix ODS-R（ 4.6 mm250 mm， 5 m），流动相甲醇 -0.1 moLL-1 乙酸铵 水 溶液（ 81 19）用于齐墩果酸和熊果酸的分离。 3.2 检测波长 、柱温及流速 的选择 考察了翼首草供试品溶液在 波长（ 205， 210， 215， 220 nm） 下 ， 柱温 （ 25， 30， 35） ， 流速 （ 1.0， 0.8

22、mLmin-1） 的色谱图及结果 ， 翼首草药材中主要含皂苷类成分，其最大吸收波长一般在 200 nm 波长左右，本实验采用 HPLC 法结合紫外分光光度法，选择 检测波长 为 210 nm， 流速 为 0.8 mLmin-1， 柱温 为 30 。 3.3 供试品溶液制备方法 的 考察 对翼首草粉末进行了不同提取溶媒（甲醇、 95%乙醇、无水乙醇、乙醚、乙酸乙酯、 三氯甲烷 ） 、 溶解样品 的溶剂 甲醇、无水乙醇 -乙酸乙酯（ 2:1） 、粉碎度 （分别过二 ， 三 ， 四 ， 五号筛） 、 提取方法（超声提取法、回流提取法） 、 超声时间 （ 功率 250 W，频率 40 KHz， 10，

23、 20， 30， 40 min）、 提取溶媒用量（乙醚 25， 50， 75， 100 mL） 、定容体积 等因素进行了考察 。结果确定提取方法为：取 翼首草粉末（过五号筛） 5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 分别 加入 乙醚 50 mL，超声处理（功率 250 W，频率 40 KHz） 20 min，冷却，滤 过 ，用少量 乙醚 润洗滤渣，合并滤液，蒸干， 分别 加 甲醇溶解并 转移至 5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀， 用 0.45 m 微孔滤膜滤过即得。 3.4 数据结果分析 本研究仅以位于 37 min 的 11 号峰为内参照峰进行表 3 中的计算，该成分在各批药材中的含量均

24、较高且分离良好。实验采用 HPLC 对 10批翼首草药材进行了测定，10 批药材共有 11 个共有峰，分离效果好，且各色谱峰保留时间相当稳定，所建立的指纹图谱具有可控性。由图 2 可见， 10 批药材指纹图谱特征峰基本一致 ; 表 2 显示，不同方法所得相似度结果趋于一致，相似度均在 0.95 以上，说明翼首草药材质量稳定。 本研究建立的翼首草指纹图谱相对于单 一成分的质量控制和模式具有较好的专属性，分析时间控制在 60 min以内，符合指纹图谱的技术标准要求。本研究结果可为翼首草的质量控制提供一定的科学依据。 3.5 对藏药翼首草 药材 质量 评价 的思考 藏药翼首草药材 在 1977 年

25、版首次载入中国药典后， 于 2010 年 再 次载入中国药典， 证 明该药材疗效确切，应用广泛，但该药材中主要成分为五环三萜皂苷类化合物，含量测定中除测定齐墩果酸和熊果酸及总皂苷 2， 17-18外，另外还测定马钱苷 12、马钱子素 13等，尽管有报道分离得到了翼首草皂苷 A， B， C， D15，但仍未能对其进行含量测定，仅以翼首草皂苷 D 为对照品对翼首草进行了薄层鉴别 16。 作者曾经就翼首草的成分进行过分离，发现翼首草的提取物再加水时呈现出 与 一般浸膏不一样的状态，很难分离 ，或许这是翼首草皂苷类成分分离难以得到的较大因素，也是翼首草药材以有效成分来评价 其质量 的一个瓶颈，仍是翼首

26、草质量评价亟待解决的一大难题，同时也是翼首草总皂苷指纹图谱在分离上的一大困难，有待学者们进一步研究。 参考文献 1 国家药典委员会 .中国药典 .一部 S 北京：中国中医药科技出版社， 2010:358 2 杨荣平 ,向春艳 ,张小梅 ,等 .不同产地翼首草中总皂苷的含量比较 J.时珍国医国药 ,2010,21 (7):1797. 3 张小梅 ,梁旭明 ,孙冠 芸 ,等 .HPLC 测定不同批次、不同产地翼首草中齐墩果酸和熊果酸的含量 J.中国现代应用药学 ,2011,28(12):1125. 4 国家中医药管理局中华本草编委会 .中华本草 藏药卷 M.上海： 上海科学技术出版社，2002：

27、366 5中华人民共和国卫生部药典委员会 .中华人民共和国卫生部药品标准（藏药） .第一册M.1995:138. 6 雷旭东 ,朱国福 ,崔文霞 ,等 .翼首草总皂苷对体外培养的肿瘤细胞增值的影响 J.时珍国医国药 ,2011,22(6):1518. 7 关昕璐 ,阎玉凝 ,魏太明 ,等 .翼首草的抗炎作用与急毒实验研究 J.北京中医药大学学报 ,2004,27 (2):71. 8 张小梅 ,杨荣平 ,励娜 ,等 .藏药翼首草薄层鉴别方法研究 J.天然产物开发与研究 ,2012,24(增刊 ): 74. 9 冯瑜娟 ,张艺 .HPLC-ELSD 法测定藏药翼首草中齐墩果酸和熊果酸的含量 J.成

28、都中医药大学学报 ,2007,30(3):54. 10 邓科君 ,张勇 ,杨宝寿 ,等 .RP-HPLC 法测定藏药翼首草中齐墩果酸与熊果酸的含量 C.地点 ： 药用植物化学与中药有效成分分析研讨会论文集 (上 ),2008:16. 11 张小梅 ,梁旭明 ,励娜 ,等 .高效液相色谱法测定翼首草不同药用部位齐墩果酸和熊果酸的含量 J.中国医院药学杂志 ,2012,32(2):155. 12 谭德 ,古锐 ,张艺 ,等 .HPLC 测定藏药翼首草中马钱苷的含量 J.中国中药杂志 ,2011,36（ 24）： 3472. 13 李文军 .藏药翼首草的化学成份及品质评价研究 D.33. 14 雷旭

29、东 ,朱国福 ,崔文霞 ,等 .翼首草总皂苷对体外培养的肿瘤细胞增殖的影响 J.时珍国医国药 , 2011,22(6):1518. 15 Wu F E, et al.翼首草中的三萜皂苷 J.Phytochem,1993,32(6):1555. 16 关昕璐 ,阎玉凝 ,任子和 ,等 .翼首草的鉴别研究 J.中国中药杂志 ,2004,29(11):1027. 17 何正有 ,张艺 ,张旭 ,等 .分光光度法测定藏药翼首草中总皂苷的含量 J.华西药学杂志 , 2002,17(1): 43. 18 林升得 ,江道峰 ,张艺 ,等 .分光光度法测定藏药翼首草不同药用部位总皂苷的含量 J.中国实验方剂学杂志 ,2013,19(5):101. 责任编辑 顾雪竹