染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结.doc

1、染色质免疫沉淀（ChIP ）实验指南及技术总结ChIP 是一项比较流行的研究转录因子（ transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于 ChIP 采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内 TF 与 Promoter 的结合情况。这个优势是 EMSA 这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA 或 RNA）之间会产生共价键。细胞内，当 TF 与 Promoter 相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使

2、它们之间产生共价键。一般 ChIP 的流程是：甲醛处理细胞收集细胞，超声破碎加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA 复合物相互结合加入 Protein A，结合抗体- 靶蛋白-DNA 复合物，并沉淀对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA 复合物 解交联，纯化富集的 DNA-片断 PCR 分析。在 PCR 分析这一块，比较传统的做法是半定量 PCR。但是现在随着荧光定量 PCR的普及，大家也越来越倾向于 QPCR 了。此外还有一些由 ChIP 衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用 ChIP 的方法研究细胞内蛋白与 RNA 的相互结合，具体方法和 ChIP

3、差不多，只是实验过程中要注意防止 RNase，最后分析的时候需要先将 RNA 逆转录成为cDNA） ；还有 ChIP-chip（其实就是 ChIP 富集得到的 DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在 ChIP 的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品） 。第一天：（一） 、细胞的甲醛交联与超声破碎。1、取出 1 平皿细胞（10cm 平皿） ，加入 243ul 37甲醛，使得甲醛的终浓度为1。 （培养基共有 9ml）2、37 摄氏度孵育 10min。3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为 0.125M。450ul 2.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置 5min 即可

4、。4、吸尽培养基，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。5、细胞刮刀收集细胞于 15ml 离心管中（PBS 依次为 5ml，3ml 和 3ml） 。预冷后2000rpm 5min 收集细胞。6、倒去上清。按照细胞量，加入 SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每 200ul 含2106 个细胞。这样每 100ul 溶液含 1106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7 长满板为 5106 个细胞。本次细胞长得约为 80。即为 4106 个细胞。因此每管加入 400ul SDS Lysis Buffer。将 2 管混在一起，共 800ul。7、超声破碎：VCX750，25功

5、率，4.5S 冲击，9S 间隙。共 14 次。（二） 、除杂及抗体哺育。8、超声破碎结束后，10，000g 4 度离心 10min。去除不溶物质。留取 300ul 做实验，其余保存于 80 度。300ul 中，100ul 加抗体做为实验组；100ul 不加抗体做为对照组；100ul 加入 4ul 5M NaCl （ NaCl 终浓度为 0.2M） ，65 度处理 4h 解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。9、在 100ul 的超声破碎产物中，加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20ul 的 50PIC。再各加入 60ul Protein A Agarose/Salm

6、on Sperm DNA。4 度颠转混匀 1h。10、1h 后，在 4 度静置 10min 沉淀，700rpm 离心 1min。11、取上清。各留取 20ul 做为 input。一管中加入 1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。（三） 、检验超声破碎的效果。取 100ul 超声破碎后产物，加入 4ul 5M NaCl，65 度处理 4h 解交联。分出一半用酚/ 氯仿抽提。电泳检测超声效果。第二天：（一） 、免疫复合物的沉淀及清洗。12、孵育过夜后，每管中加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4 度颠转 2h。13、4 度静置 10min

7、 后，700rpm 离心 1min。除去上清。14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在 4 度颠转10min，4 度静置 10min 沉淀，700rpm 离心 1min，除去上清。洗涤溶液：a. low salt wash buffer-one washb. high salt wash bufferone washc. LiCl wash bufferone washd. TE buffertwo wash15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10SDS， 100ul 1M NaHCO3， 800ul ddH2O，共 1ml。每管加入 250ul 洗脱 b

8、uffer，室温下颠转 15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管 500ul。16、解交联：每管中加入 20ul 5M NaCl（NaCl 终浓度为 0.2M） 。混匀，65 度解交联过夜。第三天：（一） 、DNA 样品的回收17、解交联结束后，每管加入 1ul RNaseA（MBI） ，37 度孵育 1h。18、每管加入 10ul 0.5M EDTA， 20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5） ，2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45 度处理 2h。19、DNA- 片段的回收 omega 胶回收试剂盒。最终的样品溶于 100ul ddH2O。（二） 、PCR

9、 分析 二、技术总结（一） 、关于细胞细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的 TF 与其靶 Promoter 的结合。一般细胞长到 7580比较好。（二） 、关于抗体！抗体是实验成败的致命因素之一！必须是 IP 级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和 santa cruz 的抗体，即使是 IP 级别的。单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在 ChIP 甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗

10、不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域） ，选择多抗比较稳妥一些。（三） 、关于交联与超声破碎！这一块的确是 ChIP 实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。交联不充分，只有一部分靶蛋白与其 Promoter 相结合，富集得到的 Promoter 的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不

11、一样。例如：NIH3T3 的交联条件是室温（ 25 摄氏度）下 15min，1的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有 bioruptor 这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是 200bp1000bp。但是 200bp2000bp 的范围也是可以接受的。（四） 、关于操作希望尽可能的保持低温（4 度） 。沉淀的时候可以先在 4 度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm 等）离心使其完全沉降。虽然说明书上说 ChIP 实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做

12、完，直到 PCR 结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。（五） 、关于解交联虽然说明书上说 4 小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA 不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在 EP 管口封上封口膜。（六） 、关于 DNA-片段的回收需要注意的是：样品中 SDS 样品较高，普通的 PCR 产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入 SDS，影响 PCR 实验结果。小 Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除 SDS 沉淀。染色质免疫沉淀（ChIP ）实验中应注意的细节问题本文来自互联网搜索，仅供参考使用，最好实验条件需要自己

13、摸索：1、cell counting：尽量做到准确，会影响 input 结果。2、cross link：甲醛的终浓度是 1%，这个基本所有的 protocol 上都会强调。3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的 tip 头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，后面的 sonication 就麻烦了。4、sonication：ChIP 中最重要的一部分，合适的条件要自己摸索，可以一次尝试不同次数的 sonication，然后建议采用 EZ-ChIP 上推荐的方法看看 sonication 的效果如何。5、加入 salmon sperm DNA/Protein A or

14、 G 之前要先混匀，因为 salmon sperm DNA 是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现 beads 的量不一样，自然也会影响实验的结果。6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸干净，必要时可用 gel loading tips 吸。7、含 beads 的 samples 离心时，有的 protocol 上推荐是 1000rpm，45 秒，但可以根据情况调整，但要注意转速不能太快防止 beads 破碎。 （当然如果采用的是 magnetic 的 beads就不存在这个问题）8、reverse crosslink 可以是 654 个小时，也可以 overn

15、ight。9、reverse crosslink 后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。10、每次行 real time PCR 之前都要把 sample 离心保证取样的准确。11、110ul 的枪取 3ul 以上才比较准确，所以考虑好自己 PCR 反应体系的配置。Upstate 生物技术公司 chip 试剂盒英文 ProtocolChIP assay: Chromatin immunoprecipitation assay was performed according to the protocol of ChIP assay kit (Upstate Bio

16、technology, Lake Placid, NY).1, For cells cultured in 2D, about 12107 S1 cells were growth in 100mm dish, and were cross-linked by adding formaldehyde to final concentration of 1% and incubated in room temperature for 10 minutes. For cells growth in 3D, cells were isolated from EHS using PBS/EDTA, a

17、nd also cross-linked as cells growth in 2D.2, Wash cells twice using ice cold PBS containing protease inhibitors (1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A). Note: Add protease inhibitors to PBS just prior to use. PMSF has a half-life of approxim

18、ately 30 minutes in aqueous solutions.3, Scrape cells into conical tube, Pellet cells for 4 minutes at 2000 rpm at 4.4, Cells were washed with PBS and resuspended in ChIP lysis buffer (1% SDS, 10mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH8.0) add protease inhibitors (inhibitors: 1mM PMSF, 1microgram/ml aprotinin and

19、 1microgram/ml pepstatin A). After incubated 10 minutes on ice, cells were sonicated to shear DNA to lengths between 200 and 1000 basepairs being sure to keep samples ice cold.5, Centrifuge samples (part A, step 7) for 10 minutes at 13,000 rpm at 4, and detected the OD260 of the lysates.6, Sonicated

20、 lysates were then diluted to OD260 2 with ChIP dilution buffer (). 60 ul protein A-agarose beads (Upstate Catalog # 16-157) was added to sonicated lysates and rotated at 4 for one hour to reduce the non-specific dinding.7, Pellet agarose by brief centrifugation and collect the supernatant fraction,

21、 20ul of lystates were taken out as input control.9, Add the immunoprecipitating antibody (the amount will vary per antibody) to the 2ml supernatant fraction and incubate 2h at 4 with rotation. For a negative control, perform a no-antibody immunoprecipitation by incubating the supernatant fraction w

22、ith 60 microliters of Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose Slurry for one hour at 4 with rotation.10, Pellet agarose by gentle centrifugation (700 to 1000 rpm at 4, 1min). Carefully remove the supernatant that contains unbound, non-specific DNA. Wash the protein A agarose/antibody/histone complex for

23、3-5 minutes on a rotating platform with 1ml of each of the buffers listed in the order as given below:Low salt wash buffer (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl); High salt wash buffer (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl); LiCl

24、buffer (0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% SDC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH8.0); TE buffer (20 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA pH8.0).11, Elute the histone complex from the antibody by adding 250 microliter elution buffer (1%SDS, 0.1M NaHCO3) to the pelleted protein A agarose/antibody/histone complex from step

25、 10 above. Vortex briefly to mix and incubate at room temperature for 15 minutes with rotation. Spin down agarose, and carefully transfer the supernatant fraction (eluate) to another tube and repeat elution. Combine eluates (total volume=approximately 500 microliters.)12, Add 20 microliters 5M NaCl

26、to the combined eluates (500 microliters) and reverse histone-DNA crosslinks by heating at 65 for 4 hours.Note: Include the input DNA from this step.13, Add 10 microliters of 0.5M EDTA, 20 microliters 1M Tris-HCl, pH 6.5 and 2 microliters of 10mg/ml Proteinase K to the combined eluates and incubate

27、for one hour at 45.14, Recover DNA by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation. Addition of an inert carrier, such as 20 micrograms glycogen, helps visualize the DNA pellet. Wash pellets with 70% ethanol and air dry.15, Resuspend pellets in an appropriate buffer for PCR or slot-blot reactions. PCR or slot-blot conditions must be determined empirically.