粪菌移植对溃疡性结肠炎肠粘膜屏障保护.ppt

1、,粪菌移植对溃疡性结肠炎肠粘膜屏障的保护,导 师：武 华 学 生：程巩,选 题 依 据,粪菌移植 炎症性肠病 肠粘膜屏障,粪菌移植,粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)是将健康人粪便中的功能菌群移植到菌群分布异常的患者胃肠道内，重建其健康的菌群分布结构，实现肠道及肠道外疾病恢复的一种治疗方式。在世界医学史上至少始于公元4世纪，但是直到近几年才得到了恢复的一种治疗方式。FMT在现代医学中的概念包括4个层面的含义：(1)从健康捐赠者粪便中分离功能菌群；(2)移植到患者消化道；(3)重建患者肠道菌群状态；(4)目的在于治疗肠内外疾病。,炎症性肠病,炎症

2、性肠病inflammatory bowel diseases IBD 是一组病因未明的累及胃肠道的慢性炎症性疾病包括溃疡性结肠炎ulcerative colitis UC和克罗恩病Crohns diseasesCD。近年来发病率呈逐年上升趋势 其病因和发病机制尚不明确，与遗传环境微生物免疫等多种因素密切相关。,肠粘膜屏障,肠黏膜是机体中一处最大的黏膜表面,它不但是营养物质消化吸收的重要场所，同时也是人体最大的细菌储存器官和病原微生物、毒素侵入机体的主要门户。肠黏膜屏障是指由机械屏障、生物屏障、免疫屏障等组成的一个复杂而又庞大的立体防御体系，其主要作用是能够有效地阻止肠道内的有害物质如细菌和毒素

3、穿过肠粘膜进入人体内其他组织、器官和血液循环，使机体内环境保持相对稳定,维持机体的正常生命活动。,当各种原因引起肠黏膜损伤、萎缩、肠道通透性增加或肠道菌群失调时，就容易导致肠道细菌易位和(或)肠源性内毒素血症，从而诱发或加重全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)或引起多器官功能衰竭(multiple organ failure, MOF)形成恶性循环。近期的研究表明：炎性肠病（IBD）病人肠黏膜对肠道内共生菌群不恰当的免疫反应是导致疾病发生发展的重要原因之一。尽管还没有确定哪一种菌对肠黏膜免疫屏障有影响，但目前的研究发现

4、IBD病人肠道内菌群的数量和丰度都较正常人低,国内外研究现状及创新之处,近年来FMT在治疗复发性肠道艰难梭状芽孢杆菌感染中取得了很好的疗效。因此，国外相继开始采用该方法治疗IBD。 但粪菌移植治疗炎症性肠病的研究目前正处于起步阶段，尚需逐步开展针对粪菌移植治疗对照研究提供更有力的依据，因此开展粪菌移植在治疗炎症性肠病中应用的研究具有深远的现实意义。本课题旨在评价粪菌移植对炎症性肠病大鼠血清DAO及D-乳酸影响，研究其对大鼠肠粘膜屏障的保护作用。从而为进一步临床应用提供依据。,国内外研究现状及创新之处,现阶段，FMT研究大部分是关于FMT治疗复发性CDI和IBD的个案或系列病例报道,但FMT导致

5、患者肠道菌群具体发生何种有益变化及其潜在的机制仍不完全清楚。本实验在于研究粪菌移植对溃疡性结肠炎大鼠肠粘膜屏障的保护作用，此项研究目前鲜有报道。,实验分组,健康雄性SD大鼠54只，体重250300g，随机分为3组： （A）空白对照组 （B）模型生理盐水组 （C）模型粪菌移植组,建立模型,大鼠造模前1 d禁食24 h，不禁水，称重后，3的戊巴比妥腹腔注射麻醉(或乙醚)，52，4，6三硝基苯磺酸(TNBS WV)按100 mgkg一150 mgkg(约等于TNBS原液O4mL06 mL相当于200 g大鼠20 mg30 mg)；分别加入乙醇；体位为头朝下，用聚丙烯管插入肛门上段8 cm，注射器注人

6、。再倒立15 min左右，以防药液溢出，UC一次性灌肠。 新鲜粪菌液制备流程：将供体新鲜粪便样本置于搅拌器中，09NaCl溶液进行初步均质加工（新鲜粪便与09NaCl溶液的比值为1:5）；将粪便浆体经不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质；冰上转运至实验室并在采集后2h内进行处理；将样本在氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中进一步匀质处理；浆体逐级经过直径20mm、10 mm、05mm和025mm的不锈钢滤网过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；将再次过滤的样本以6000转min的速率离心15min，并将沉淀再悬浮于09NaCl溶液中，得几乎无色无味的粪菌液。获得的新鲜粪菌液可立即进行移植，也可

7、加入无菌甘油后置于一80作为冰冻样本保存18周。,干预措施,三组大鼠按大鼠正常灌肠剂量灌入粪菌移植液及生理盐水。A、B组给生理盐水灌肠；C组给予粪菌移植液。饲养期间,于第3、7、11天3个时间点每组分别取5只大鼠取血测量相关指标，并取肛门以上8cm肠段卷起，置10中性甲醛中固定，石蜡包埋、切片、HE染色后显微镜下观察。在光镜下观察组织损伤程度并采用Chiu氏6级评分法评估损伤程度,检测指标及意义,D-乳酸 D-乳酸是肠道固有细菌的代谢终产物，几乎哺乳动物机体的各种组织均不产生D-乳酸，也没有代谢分解D-乳酸的酶系统，所以血浆中的D-乳酸基本上来源于肠道。当肠道发生急性缺血时，局部细菌大量增殖，

8、破坏了肠粘膜的生物屏障，由于肠缺血致肠粘膜绒毛顶端上皮脱落，细胞旁路途径增加而致肠粘膜通透性增加，此时肠道中细菌产生的大量D-乳酸通过受损粘膜经循环入血，故监测血中D-乳酸水平可及时反映肠粘膜损害程度和通透性变化。,检测指标及意义,血浆二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活性测定 DAO是肠粘膜细胞的标志物，存在于哺乳动物小肠绒毛上层，在其他组织和细胞中几乎不存在，生理状况下血浆中DAO活性很低，在肠粘膜受损时，由肠粘膜细胞释放的DAO大量入血，使血中浓度大幅度上升。有研究证实，血浆DAO活性升高的时相早于内毒素和D-乳酸，提示血浆DAO活性作为反映肠屏障功能损伤指标不仅特异度

9、强，灵敏度也较高，且检测方法简便、费用低，是反映肠粘膜结构完整性较理想的指标。,检测指标及意义,HE染色后光镜观察组织病理改变。,雄性SD大鼠模型,空白对照组,粪菌移植组,于3、7、11天各处死6只大鼠,测血清指标浓度取结肠组织HE染色后光镜观察,数据SPSS13.0统计软件分析,技 术 路 线,生理盐水组,统计学分析,采用Spss13.0统计软件包进行分析，各组实验数据用均数标准差表示，血清学指标比较采用单因素方差分析，P0.05表示差异有统计学意义。,预期成果,给予生理盐水保留灌肠的溃疡性结肠炎大鼠与给予粪菌水保留灌肠的溃疡性结肠炎大鼠相比，血清DAO及D-乳酸检测值增大，说明粪便菌群移植

10、对于溃疡性结肠炎大鼠的肠黏膜屏障具有保护作用。 给予粪菌水保留灌肠的溃疡性结肠炎大鼠与给予生理盐水保留灌肠的溃疡性结肠炎大鼠相比，炎症性肠病病理下观察损伤较轻。,研究计划,研究基础,与本课题有关的，前期研究工作积累和已取得的研究工作成绩已参阅大量与课题相关的中英文文献及与本课题参考性较强的相关研究资料和理论。导师武华教授有深厚的学术造诣和丰富的临床经验以及实验室实践能力，可为实验提供理论技术指导。已基本掌握动物饲养、免疫组化等试验操作的基本要领。,研究基础,已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况） 山西医科大学中心实验室拥有进行

11、细胞培养和分子生物学实验的设备和技术力量，包括荧光及倒置显微镜、医学图象处理系统和低温冰箱等主要仪器设备，同时可利用生理实验室及相关科室的仪器设备。实验所需的相关的分子生物学试剂和免疫组化试剂均可从基因工程公司和试剂公司购买。动物中心实验室有饲养动物的动物房和饲养条件。 分子免疫实验室和动物中心的指导老师有丰富的理论实验技术和操作经验，可为实验提供操作理论技术指导。,经费预算,参考文献,1.Harrison OJ Maloy KJ. Innate immun eactivation inintestinal homeostasis. J Innate Immun，2011，3:585-5932

12、.McGuckinMA，Eri R，Simms LA，etal.Intestinal barrier dysfunction In inflammatory bowel diseases Inflamm Bowel Dis，2009，5:100-1133.Lewis K, Caldwell J, Phan V, Prescott D, Nazli A, Wang A, Soderhlm JD, Perdue MH, Sherman PM, McKay DM. Decreased epithelial barrier function evoked by exposure to metaboli

13、c stress and nonpathogenic E. coli is enhanced by TNF-alpha. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008; 294: G669-G6784.Laukoetter MG,NavaP，Nusrat A Roleof the intestinal barrier in inflammatory bowel disease World J Gastroenterol，2008，14:401-4075.李悦，武华，复合膳食纤维对炎症性肠病大鼠肠黏膜屏障的保护作用 J 中国医药导报 2010年5月第7卷第13期6.Xavier RJ, Podolsky DK. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease J. Nature,2007,448(7152):427-434,谢谢大家,谢谢大家！,