醋酸木质素结构特性及抗氧化性.DOC

1、醋酸木质素结构特性及 抗氧化 性 龚卫华 1， 胡强 2,3，向卓亚 4， 赵国华 4*，彭英 5 （ 1.吉首大学师范学院，湖南 吉首 416000； 2.竹类病虫防控与资源开发四川省重点实验室，四川 乐山 614000； 3. 乐山师范学院 生命科学学院，四川 乐山 614000； 4.西南大学 食品学院，重庆 400715； 5.长沙一加一生物科技有限公司，湖南 长沙 410000） 摘要： 采用醋酸法提取 大叶 麻竹笋笋壳中木质素， 并对得到的醋酸木质素进行 表面微观特性、结晶特性、热稳定性 、 吸湿特性 及 抗氧化能 力 测定 ， 同时 与相同来源的纤 维残渣和粗膳食纤维进行对比 实

2、验 。结果表明，醋酸木质素 表面 呈 球形且结构粗糙多孔 ， 以无定形结构存在 ， 热稳定性较 好 ，最大失重 速 率为 0.34%/ ，吸湿率 较低（ 5.21%） 。 DPPH 自由基清除能力和亚铁离子还原能力（ FRAP） 测定结果表明 ，醋酸木质素抗氧化能力高于人工合成的抗氧化剂 BHT，其 ABTS 自由基清除能力与 BHT 相当，无显著差异。 并 且醋酸木质素的抗氧化能力显著高于相 同来源的纤 维残渣和粗膳食纤维。 关键词： 大叶麻竹笋；笋壳；醋酸木质素； 结构特性； 抗氧化活性 中图分类号： TQ911 文献标识码： A Structural Characteristics an

3、d Antioxidant Activities of Acetic Acid Lignin GONG Weihua 1, HU Qiang2,3, XIANG Zhuoya4, ZHAO Guohua 4*, Peng Ying5 (1. Normal College of Jishou University, Jishou 416000,Hunan, China; 2. Bamboo Diseases and Pests Control and Resources Development Key Laboratory of Sichuan Province, Leshan 614000,S

4、ichuan, China; 3.College of Life Science, Leshan Normal University, Leshan 614000,Sichuan, China； 4.College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 5.Changsha PlusOne Biotechnology Co., Ltd,Changsha 410000,Hunan,China) Abstract： Lignin was extracted from bamboo(Dendrocalamus

5、latiforus Munro) shoot shell by acetosolv process.The surface microscopic characteristic, crystalline characteristic, thermostability, moisture-absorbing characteristics and antioxidant activities of acetic acid lignin (AL) were investigated and compared with the same source of cellulose residue and

6、 coarse dietary fiber. The results showed that the AL was spherical and coarse surface with many pits, with amorphous structure， good thermal stability and the maximum weight loss rate was 0.34%/oC and low moisture absorption(5.21%). In terms of the DPPH radical scavenging activity and ferric reduci

7、ng antioxidant power (FRAP), AL showed stronger antioxidant activity than the commercial synthetic antioxidant BHT. But there was no significant difference in the ABTS free radical scavenging ability of AL and BHT. The antioxidant capacity of AL was significantly higher than that of the same source

8、the cellulose residue coarse dietary fiber. Keywords: dendrocalamus latiflorus munro;bamboo shoot shell;acetic acid lignin;structural characteristics;antioxidant activities 基金项目 : 竹类病虫防控与资源开发四川省重点实验室科研项目（ 17ZZ014） 作者简介：龚卫华（ 1980 ），女，讲师，博士 。 联系人：赵国华（ 1971 ），教授， 电话：13983703172， E-mail： 。 Foundation it

9、em: Bamboo Diseases and Pests Control and Resources Development Key Laboratory of Sichuan Province Research Project (17ZZ014) 大叶麻竹 笋 (Dendrocalamus latiflorus Munro)是 丛生竹笋的一种，适应性 强 ，产量高，近年来得到广泛 种植 ， 是中国产笋量较高的品种之一 1。笋壳是竹笋成竹后脱落下来或者竹笋经加工后的副产品，其量占竹笋总量的一半以上，大部分被当作废物丢弃，造成环境污染。笋壳主要成分为纤维素和木质素，如能利用笋壳资源制备木质素和

10、纤维素意义重大 2-3。 木质素是具有三维立体结构的天然酚类无规则聚合物，是非水溶性膳食纤 维成分之一，是 自然界中仅次于纤维素的第二大天然高分子材料， 广泛应用于农业、工业、医药业和食品业 4-5。木质素由苯丙烷结构单元组成，含有较多的活性基团，具有多种生物学活性 6 -8，如具有自由基清除和抗氧化、抗癌变、吸附胆汁酸以及提高动物体内蛋白质利用率等。 Vanessa等 9还进一步研究木质素作为抗氧化剂对人体 的 影响，结果表明木质素对皮肤和眼睛无伤害，具有应用于化妆品和医疗行业的潜力。 本文对木质素的微观表面特性、结晶特性、热稳定性和吸湿特性进行分析，以期了解笋壳木质素资源内在结构特性，为生

11、物活性的研 究提供理论基础。并选取 3 种常见的抗氧化实验：清除自由基 DPPH、 ABTS 和亚铁还原能力（ FRAP）， 测定 了 木质素 的 抗氧化特性。并 与 相同来源的纤维残渣和粗膳食纤维进行对比 实验 ，以 期能说明木质素作为粉体抗氧化剂应用的可能，为笋壳资源的高附加值应用提供方向。 1 实验部分 1.1 原 料、试剂与仪器 大叶麻竹笋笋壳：采于重庆市北碚区竹林 ； ABTS、 Trolox、 TPTZ：试剂纯，美国 Sigma公司； DPPH、 BHT：分析纯，阿拉丁试剂有限公司 ；甲醇：色谱纯，成都科龙化工试剂厂 ；微晶纤维素： 分析纯，成都成都科龙 化工试剂厂 。 S-300

12、0N 扫描电镜 （ 日本日立仪器有限公司 ） ； D8 Advance X 射线 衍射仪 （ 德国布鲁克公司 ） ； SF/1382 热重分析仪 （ 瑞士梅特勒公司 ） ； 88-1 大功率恒温磁力搅拌器 （ 常州国华电器有限公司 ） ； RE-52AA 旋转蒸发器 （ 上海亚荣生化仪器厂 ） ； SHB- 循环水式多用真空泵 （ 郑州长城科工贸有限公司 ） ； LGJ-10 冷冻干燥机 （ 北京松源华兴科技发展有限公司 ） ； DHG-9 电热恒温鼓风干燥箱 （ 上海齐欣科学仪器有限公司 ） ； L535-1 低速离心机 （ 长沙湘仪离心机仪器有限公司 ） ； 722 可见光分光光度计 （

13、北 京金科利达电子科技有限公司 ） 。 1.2 方法 1.2.1 粗膳食纤维的提取 参考文献 10的方法，制得 粗膳食纤维粉。 1.2.2 木质素和纤维残渣的提取 称取一定量粗膳食纤维粉，按照液料比 20:1（ V/m， mL/g）加入 体积分数为 87%醋酸溶液，并添加 质量分数 6%的盐酸作为催化剂，在 114 油浴条件下反应 80min 后，真空抽滤，滤渣用 体积分数为 87%醋酸冲洗，并用纯水冲至中性，滤渣冷冻干燥 即 得纤维素残渣。滤液减压浓缩至 50mL，浓缩液逐滴加入 500mL 纯水中沉淀，离心分离，用 pH=2 的酸水（ 0.1mol/L HCl 溶液调节 pH）溶液冲洗 3

14、 次，冷冻干燥，得笋壳醋酸木质素 11。 1.2.3 表面特性分析 扫描前对样品表面进行喷金处理，加速电压为 3.0kV， 摄取不同放大倍数（ 1000、 10000和 50000 倍）的照片。 1.3 性能测定 1.3.1 结晶特性 测定条件为辐射源 CuK ；管压 40kV，管流 40mA；扫 描 范 围 540，扫 描 速 度 5()/min，步长 112。 1.3.2 热重分析 测试前 将 样品 粉末 于 105 干燥 2h。 取 10mg 样品置于坩埚中（ Al2O3），氮气流速（ 50mL/min），加热 速率（ 10 /min），测试温度范围为 30700 13。 1.3.3 吸

15、湿性 采用 静态称重测试法 14， 将干燥的样品分别置于预先恒重的称量皿中，称重后，放入35 、 相对湿度 75%（饱和氯化钠溶液调节）的恒温培养箱中，密封后进行吸湿性 实验 ，每隔 1h 测一次试样的质量 。 1 0 0 %/ 2 21m mm 吸湿率 （ 1） 式中： m1 为吸湿后称量皿和样品的质量； m2 为吸湿 前 称量皿和样品的质量。 1.3.4 DPPH自由基清除能力测定 参照 陶 兵兵 等 15的方法略作改动， 称取 不同质量的 4 种样品 粉末（ 醋酸木质素、 BHT的质量为 0.0250.5mg（微晶纤维素固体稀释）， 纤维残渣的质量为 1.013.0mg，粗膳食纤维的质量

16、为 5.019.0 mg） 分别 放入 10mL 试管中，加入 3.5mL 浓度为 0.06mmol/L 的DPPH 溶液（ 甲醇 为溶剂 ），漩涡振荡 2min 后，室温下避光反应 30min，然后以 8000r/min离心 5min，取上清液于 517nm 处测定吸光值 As。同时，测定空白样吸光值 Ab 和样品对照吸光度 Ad（甲醇溶液代替 DPPH 溶液所测吸光度），按下式计算样品对 DPPH 自由基清除率（ S%）： 100 % b dSb A AAAS (2) 1.3.5 ABTS 自由基清除能力测定 参照 Nenadis 等的方法 16略作改动， ABTS 用纯水溶解，得到 7m

17、mol/L 的 ABTS 溶液，取 5mLABTS 溶液和 88L 140mmol/L K2S2O8 溶液加入 20mL 棕色容量瓶中（ ABTS 溶液最终浓度为 2.45mmol/L）。然后 ， 将此 混合液在室温下避光反应（ 1216h）。将 此 ABTS 自由基溶液用磷酸缓冲液（ pH7.4）稀释，使其在 734nm 处的吸光值为 0.700.05，以此为 ABTS自由基工作液。 称取不同质量的 4 种样品粉末 （ 醋酸木质素、 BHT 的质量为 0.0080.05mg，纤维残渣的质量为 0.30.9mg，粗膳食纤维的质量为 0.41.6 mg（微晶纤维素固体稀释） ） 分别 放入10m

18、L 试管中 ， 加入 3.5mL 的 ABTS 自由基工作液，混匀后 30C 水浴反应 3min，然后以8000r/min 离心 3min，取上清液于 734nm 处测定吸光值 As，同时，测定空白样吸光值 Ab和样品对照吸光度 Ad（磷酸缓冲液代替 ABTS 溶液所测吸光度），按式 (2)计算样品对 ABTS自由基清除率。 1.3.6 FRAP能力测定 参照 Benzie 和 Strain 的方法 17略 作 改动，将 25mL 醋酸缓冲液（ 300mmol/L， pH3.6）、2.5mL FeCl36H2O（ 20mmol/L）和 2.5mL 2,4,6-三（ 2-吡啶基）三嗪（ TPTZ

19、）溶液（ 10mmol/L，用 40mmol/L 盐酸配制），混匀后得到 FRAP 工作溶液（现配现用）。 准确称取 质量为 0.1mg 的 3 种样品粉末（微晶纤维素固体稀释） ，放入 10mL 试管中，加入 3.5mL FRAP 工作溶液，漩涡 振荡 2min， 混匀 后 37C 水浴反应 5min，然后以 8000r/min离心 3min，上清液于 593nm 处测定吸光值 As，同时测定样品对照的吸光度 Ad（以配制 FRAP的混合溶液来代替 FRAP 溶液测定吸光度）。以 FeSO47H2O 溶液浓度（ mol/L）为横坐标（ x），以吸光值为纵坐标（ y），绘制标准曲线 。得到 线

20、性回归方程为： y=5.0910-4x+0.093， R2=0.990 在 FeSO47H2O 溶液浓度 为 0 1100mol/L 时 线性关系良好。 抗氧化的 结果表 示为 1g 样品粉末抗氧化能力的 FeSO47H2O 的当量 （ mol FEAC/ g dw） ，值越 大 ， 其抗氧化活性越强。 2， 6-二叔丁基对甲苯酚（ BHT）是一种常用的人工合成的抗氧化剂，在抗氧化 实验 中，作为抗氧化剂的阳性对照，用来对比分析 各 样品粉末的抗氧化性。 2 结果与 讨论 2.1 微观表面特性分析 不同粉末样品 在 1000、 10000 和 50000 倍放大倍数 下 的扫描电镜 照片， 见

21、图 1。可以看出，醋酸木质素样品呈圆球状，表面粗糙，在放大 50000 倍的电镜图上清晰 地 观察到许多的小孔，这些微观结构将为木质素 生物活性提供结构支持，特别在 吸附能力 方面 18。从纤维残渣和粗膳食纤维的电镜图中可以看出，这 两种粉末样品颗粒呈现出片状结构，且从 50000倍的电镜图上看不出明显的排列规律 。 图 1（ A） 醋酸 木质素 、 （ B）纤维残渣和（ C）粗膳食纤维的扫描电镜图 Fig. 1 Scanning electron microscope of (A) AL, (B) and cellulose residue and (C) coarse dietary fi

22、ber 2.2 结晶特性分析 图 2为 3个样品粉末的 X射线 衍射 谱 图。如图 2所示，纤维残渣和粗膳食纤维在 2=15.89和 21.88的位置有两个明显的特征峰，是典 型 I 型纤维素晶体的衍射峰 19。醋酸木质素样品没有明显的特征峰，说明木质素是以无定形态结构存在。由图 2 还 可以看出，粗膳食纤维衍射峰的强度较纤维残渣低，是因为粗膳食纤维中的木质素和半纤维素的含量比纤维残渣高引起的 20。 5 10 15 20 25 30 35 40强度2 (0)CBA图 2（ A） 醋酸 木质素 、 （ B）纤维残渣和（ C）粗膳食纤维的 XRD 谱 图 Fig. 2 X-ray diffrac

23、tion patterns of (A) AL, (B) cellulose residue and (C) coarse dietary fiber 2.3 热稳定 性 分析 3 种样品 的热 失重分析曲线 如图 3 所示 。 在起始阶段 ， 3 种样品粉末均出现少量失重，主要是因为水分蒸发所致。结果表明，醋酸木质素的热分解范围较宽， 在 160600 都有分解，在 220410 内 分 解最快，这主要取决于木质素的 -O-4的含量和木质素侧链的氧化情况 21。 温度升到 700 后，醋酸木质素残炭率为 38.94%，这主要与木质素的碳碳键含量有关 13。纤维残渣热分解 温度 范围最窄，为

24、320370 ，主要是因为纤维残渣的主要成分为纤维素，而纤维素结构较单 一，热分解范围很窄 15， 700 的残炭率为 19.27%。粗膳食纤维热分解范围和残炭率分别为 250350 和 29.37%。 DTG 为不同温度下相应质量的降解速率。样品的热稳定性可以通过最大失重率 （ DTGmax）来表示 。 如图 3 所示，醋酸木质素、纤维残渣和粗膳食纤维 DTGmax对应的分解温度 分别 为 358.83、 356.17 和 326.00 ，最大失重速率分别为 0.34、 2.47 和 0.59%/ 。由以上数据可知，醋酸木质素的热稳定性最好，这将有利于扩大醋酸木质素的 应用范围。 0 100

25、 200 300 400 500 600 700 80020406080100失重率 (%)温度 ( )ACB0 100 200 300 400 500 600 700 800-2 .5-2 .0-1 .5-1 .0-0 .50 .00 .5失重求导 (% / )温度 ( )B 356. 17 C 326. 00 A 358. 83 图 3（ A） 醋酸 木质素 、 （ B）纤维残渣和（ C）粗膳食纤维的 TG-DTG 分析曲线 Fig.3 TG-DTG curves of (A) AL, (B) cellulose residue and (C) coarse dietary fiber 2

26、.4 吸湿特性 3 种粉末样品的吸湿特性见图 4，在开 始的 1h， 3 种粉末样品的吸湿速率都很快，后来逐渐减缓。醋酸木质素在 5h 左右吸湿能力到达平衡，吸湿率为 5.21%。而纤维残渣和粗膳食纤维达到平衡 时 的 吸湿率分别为 11.21%和 12.95%， 要远远高于醋酸木质素，这可能 与 粉末样品的粒径、分子结构等相关，而且木质素内部呈疏水性，导致持水 性能较低。 0 1 2 3 4 5 6 7 8 902468101214吸湿率 (%)时间 ( h )ABC图 4（ A） 醋酸 木质素 、 （ B）纤维残渣和（ C）粗膳食纤维的吸湿特性 Fig. 4 Moisture-absorb

27、ing characteristics of (A) AL, (B) cellulose residue and (C) coarse dietary fiber 2.5 抗氧化能力分析 2.5.1 DPPH和 ABTS 自由基清除率 DPPH 和 ABTS 都是稳定的自由基，可以接受氢自由基和电子，抗氧化剂对它们的清除效果代表了它的供氢能力，是抗氧化研究中常用的两种自由基。 醋酸木质素对 DPPH 和ABTS 自由基的清除率见图 5、 6。 IC50值表示自由基清除率为 50%时，抗氧化剂的浓度，其值越小 ， 抗氧化性越强。由表 1 所示，醋酸木质素的清除 DPPH 和 ABTS 自由基的

28、IC50值分别为 0.024 和 0.005g/L，要远远高于纤维残渣和粗膳食纤维，与人工合成的抗氧化剂 BHT相当，甚至清除 DPPH 自由基的能力要显著高于 BHT，与 Sun 等 23的结果一致，这主要与醋酸木质素结构中的活性功能基团及分子量有关。醋酸木质素中含有很多的酚羟基，且分子量较低，这都有利于提高醋酸木质素的抗氧化性 9,11。有研究表明，木质素对 DPPH 自由基的清除是电子和质子同时转移机制，而对 ABTS 自由基的清除则是电子或者质子转移机制11。同时醋酸木质素中还含有较多的醇羟基，但是，醇羟基对于木质素抗氧化的影响存在争议，有研究者 24认 为 ， 醇羟 基含量对于木质素

29、的抗氧化有正面的影响，也有研究者 25认为醇羟基的含量对木质素的抗氧化有负面影响，需要进一步去验证。且认为木质素中羧基的含量有助于提高木质素对 ABTS 自由基的清除。由图 5、 6 可以看出，纤维残渣和粗膳食纤维都具有一定清除 DPPH 和 ABTS 自由基的能力，纤维残渣的抗氧化能力强于粗膳食纤维，这可能与纤维残渣含有一些抗氧化的成分有关 。 0 2 4 6 8 10 12 140204060801000. 00 0. 02 0. 04 0. 06 0. 08 0. 10 0. 12 0. 14102030405060708090100DPPH自由基清除率(%)浓度 ( m g /m L

30、)BHT醋酸木质素纤维残渣粗膳食纤维AB H T醋酸木质素DPPH自由基清除率(%)浓度 ( m g/ m L )B图 5（ A） 醋酸 木质素、 BHT、 纤维残渣和粗膳食纤维对 DPPH 自由基 清除率 ， （ B）醋酸 木质素 和 BHT对 DPPH 自由基 清除率 的放大图 Fig. 5 (A) Scavenging abilities of AL, BHT, cellulose residue and coarse dietary fiber on DPPH radical and (B) Amplification figure of Scavenging abilities of

31、 AL and BHT on DPPH radical 0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0 1 .2 1 .420304050607080901000. 002 0. 004 0. 006 0. 008 0. 010 0. 012 0. 0142030405060708090100ABTS自由基清除率(%)浓度 ( m g /m L )BHT醋酸木质素纤维残渣粗膳食纤维AABTS自由基清除率(%)浓度 ( m g/ m L )B H T醋酸木质素B图 6（ A） 醋酸 木质素、 BHT、 纤维残渣和粗膳食纤维对 ABTS 自由基清除率 ，（ B）醋酸 木质 和 BHT

32、对ABTS 自由基清除 率 的放大图 Fig. 6 (A) Scavenging abilities of AL, BHT, cellulose residue and coarse dietary fiber on ABTS radical and (B) Amplification figure of Scavenging abilities of AL and BHT on ABTS radical 表 1 醋酸 木质素、纤维残渣和 粗 膳食纤维的 IC50 值 Table 1 IC50 of acetic acid lignin, cellulose residue and coars

33、e dietary fiber 注： 不同英文字母表示同 列 的数据 之间 差异显著 。 2.5.2 FRAP 能力的测定 FRAP 法是测试抗氧化剂将 TPTZ-Fe3+复合物还原为 TPTZ-Fe2+复合物的能力，从而评价其抗氧化能力强弱的一种方法。如图 7 所示，醋酸木质素的抗氧化能明显强于 BHT、纤维残渣和粗膳食纤维，这可能不仅与木质素中的羟基含量有关，也有研究表明，木质素结构中的共轭双键对 FRAP 的能力也至关重要 11。 BHT 醋酸木质素 纤维残渣 粗膳食纤维02004006008001000FRAP (mol FE/gdw)aabc图 7 醋酸 木质素、纤维残渣和粗膳食纤维

34、的 FRAP 能力（不同小写字母表示不同数据之间差异显著） Fig. 7 FRAP abilities of AL, cellulose residue and coarse dietary fiber (Data bearing different lowercase letters are 样品 IC50/ (g/L) DPPH ABTS BHT 0.0300.002b 0.0040.0002a 醋酸木质素 0.0240.002a 0.0050.0002a 纤维残渣 0.8640.04c 0.1880.01b 粗膳食纤维 4.8920.23d 0.2840.02c significantl

35、y different) 通过以上 3 种抗氧化能力 测试 ，醋酸木质素都表现出很强的抗氧化性，而且木质素来源广泛，安全无毒，有用于食品、化妆品等行业做抗氧化剂的潜力，这将为笋壳资源和笋壳木质素的应用提供一个好的方向 。 3 结论 通过对醋酸木质素的表面微观特性、结晶特性、热稳定性、吸湿特性和抗氧化活性的研究发现，醋酸木质素以无定形结构存在，表面 呈 球形且 结构粗糙多孔；与相同来源的纤维残渣和粗膳食纤维相比，其热稳定性较好，但吸湿能力较差。在抗氧化活性方面，其 DPPH自由基清除能力和亚铁离子还原能力要强于人工合成的抗氧化剂 BHT，在 ABTS 自由基清除能力方面与 BHT 无显著差异，但

36、醋酸木质素的抗氧化能力要明显高于对照组纤维残渣和粗膳食纤维。 参考文献 ： 1 Wu Jinsong (吴金松 ), Zheng jiong (郑炯 ), Xia Xuejuan (夏雪娟 ), et al. Separation and purification of polysaccharides from ma bamboo shoot (Dendrocalamus latiforus)J. Food Science (食品科学 ), 2015, 36(2): 80-84. 2 Jia Yanfang (贾燕芳 ). Research on the utilization of fibe

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