民院-检验核医学放射免疫分析和免疫放射分析.ppt

1、检验核医学,第六章 体外分析技术In vitro analysis techniques,概述,体外分析技术（in vitro analysis techniques） 1. 广义地讲，是泛指以离体组织、血液或体液等作为生物样本，在人体外进行的、分析样本中成分或其含量的检测技术。以体外放射性核素标记配体（ligand）为示踪剂，以结合反应为基础，以放射性测量为定量手段，在试管中进行的对微量生物活性物质进行定量分析的标记免疫分析技术。主要指放射免疫分析技术（radioimmunoassay, RIA） 2.主要检测放射性核素发射的射线量,第一节 放射免疫分析,一、基本原理1. 放射免疫分析（RI

2、A）是利用放射性标记的抗原（ *Ag ）与非标记抗原（ Ag ）同时与限量的特异性抗体（Ab）进行可逆性竞争性免疫结合反应。,* Ag + Ab * Ag -Ab + * Ag + Ag Ag-Ab + Ag * Ag和 Ab量恒定,2. 标准曲线:利用一系列已知浓度的标准Ag(即标准品)与待测样品在相同条件下反应后，用放射计数仪测定*Ag Ab(B)或游离的*Ag （F）的放射性。以各浓度点测量的相应的放射性计数（cpm）或用计算参数 B/(B+F),B/F或B/B0为纵坐标作图绘制标准曲线。 a) Ab和*Ag 的量恒定 b) 抗原抗体反应为可逆性 c) Ab和*Ag 的性质与结构相同,特

3、点 1.灵敏度高 最小可测量为10-9-10-15g 2.特异性强 利用专一性强的结合反应 3.精确度好 有效的质量控制方法 4.放射性不引入体内 5.所需待测样品少 50-200l 6.试剂药盒化，操作简便、快速 7.测量微机化，方便、快捷，客观、准确,类型 竞争性体外放射分析 标记物 结合剂 放射免疫分析 *Ag Ab (RIA) 竞争蛋白结合分析 *Ag 血浆中固有的 (CPBA) 激素载体蛋白 (TBG) 放射受体分析 *L R (RRA) 放射酶分析 *S E (REA) 非竞争性体外放射分析 免疫放射分析 *Ab *Ab (IRMA) 受体的放射分析 *L R (RBA) 酶的放射

4、分析 *S E (ERA),放射免疫分析(RIA),基本原理1 RIA反应式 分离剂 *Ag + Ab *Ag-Ab *Ag-Ab + 分离剂 Ag Ag-Ab Ag-Ab 1)一定量*Ag 、不定量Ag与限量Ab进行竞争抑制结合反应2) *Ag-Ab 与Ag成负相关关系(反比)3)在实际工作中，用一系列已知浓度的Ag(标准品)进行实验制备剂量反应曲线(标准曲线， *Ag-Ab Ag曲线)，未知样品在相同条件下实验，其浓度通过标准曲线查出,2 RIA数学函数式 k1 Ag + Ab Ag-Ab k2 P + Q PQ P = Ag + *Ag P0 = Ag0 + *Ag0 Q = Ab Q0

5、 = Ab0 PQ = Ag-Ab + *Ag-Ab k1 PQ PQ K = = = (1) k2 P Q P (Q0-PQ) PQ = (2) (P0-PQ) Q,将B = PQ / P0、B / F = B / (1-B) = PQ / P代入(1) B 1 K = (3) 展开重排 1 B Q0 - B P0 Q0 1 Q0 B2 B (1 + + ) + = 0 (4) P0 K P0 P0 将B = 1 - F代入(3) Q0 1 1 F2 F (1 - - ) + = 0 (5) P0 K P0 K P0 定义R = B / F，由B + F = 1得B = R / (1+R)代

6、入(3) R2 + R ( 1 + K P0 K Q0 ) K Q0 = 0 (6),3 RIA剂量反应曲线,4 方法流程 加样温育分离测定数据处理 签发检测报告,基本试剂 1标准抗原(Ag) 2标记抗原(*Ag) 3抗血清(抗体，Ab),1 标准抗原(Ag) 已知含量的非标记抗原 用途(1)免疫动物，制备抗体 (2)制备标记抗原 (3)作为标准品参与RIA反应，绘制剂量反应曲线 要求(1)质量上高纯度 与被测抗原属同一物质，具有 相同的免疫(生物)活性，高度纯化 (2)数量上高准确度 分一级标准(国家或国际标准) 二级标准(厂家或实验室标准) (3)稳定性好，便于贮存、运输和使用,2 抗血清

7、(抗体，Ab) 含有抗体的血清 质量指标 (1)亲和力 (2)交叉反应率 (3)滴度,(1)亲和力 Ab与Ag的结合能力，用亲和常数K表示 Scatchard作图法得： B/F = KQ0 KPQ 为一直线 K = 直线斜率 K 109L/mol,(2)交叉反应率 Ab与Ag类似物的结合程度，表示Ab的特异性。分别用Ag和Ag类似物（Ag#）作剂量反应曲线 Ab与 *Ag结合 被抑制50% 时Ag量交叉反应率= Ab与 *Ag结合 被抑制50% 时Ag#量,(3)滴度 又称效价，反映与一定量 Ag特异结合的Ab的浓度,用稀释度表示 用一定量标记Ag与不同稀释度的Ab反应，作B%-Ab稀释度曲线

8、，B%=50%时对应的Ab稀释度即为Ab滴度, 合适的滴度为1:104-106,3 标记Ag 常用125I和3H标记化合物 要求： (1)适当高的放射性比活度 影响方法的灵敏度和 精密度，标记Ag化学量被测Ag的最小量 (2)放射化学纯度95% 影响方法的灵敏度 (3)免疫活性与未标记Ag基本保持一致 (4)稳定性好，在一定条件下，稳定期1-3月,标记Ag与Ab的用量对测定的影响 (1)待测Ag含量较高*Ag的比活度 Ab的滴度 灵敏度 曲线范围 (2)待测Ag含量较低*Ag的比活度 Ab的滴度 灵敏度 曲线范围,分离技术1 非特异性 (1)吸附法 分离剂：葡聚糖凝胶包被活性炭(DCC) F被

9、吸附沉淀，重复性差 (2)沉淀法 分离剂：聚乙二醇(PEG) B被沉淀，分离迅速， 非特异结合率高 (3)抽滤法 常用滤膜：玻璃纤维滤膜、微孔滤膜 B与F的分子量差别明显时分离效果好,2 特异性分离方法 (1)双抗体法 分离剂：第二抗体 (抗抗体， Ab2) 分离时间长，非特异结合率低 (2)双抗体+PEG法 分离迅速，非特异结合率低 (3)固相分离法 固相材料包被Ab1、Ab2 固相材料：纤维素(包被珠) 试管(包被管) 磁化颗粒,分析方法1 反应方式(1)平衡加样法： 标准(待测)Ag + Ab + 标记 Ag 温育分离 测定(2)顺序加样法： 标准(待测)Ag +Ab温育+标记Ag温育分

10、离测定提高方法灵敏度的分析方法,2 反应介质 Tris-HCl或PB缓冲液，pH7.4-7.8 离子强度0.05-0.1M3 反应温度和时间 K大，37C，1-3h；K小，4 C，过夜4 血样的采集与保存 (1)大都采用原样品(血清、血浆)，少数需经提取 (2)不及时分析的样品需分离出血清或血浆，-20 C存放 (3)采样或反应时常用抗凝剂：EDTA-Na2，防腐剂： NaN3，稳定剂：0.5% BSA、0.1%明胶、抑肽酶等,RIA反应管类型 组 类型 基本反应试剂 分离 别 名称 常用符号 Ag Ab *Ag 试剂 总放射性管 T - - - 标准 非特异结合管 N - - 曲线组 最大结

11、合管 B0(S0) - 标准管 Si 样品组 样品管 U 质控组 质控管 QC ,数据处理 1 B% D 曲线 2 B% LogD 半对数反“S”曲线 3 B/B0% LogD 半对数反“S”曲线 4 Logit B/B0 LogD 全对数直线 5四参数或五参数Logistic模型 曲线 6四参数单位点质量作用模型 曲线,RIA的质量控制 质量控制的目的 对分析工作中产生的误差进行检查和质量判断，对出现的质量异常现象寻找原因并采取纠正措施，以保证分析误差被控制在允许的范围内。杜绝过失误差，校正系统误差，控制随机误差。,质量控制的内容(任务)1实验室内部质量控制 (1)批内质控 精密度评价 偏差

12、分析 (2)批间质控 精密度评价 偏差分析2实验室外部质量控制(1)对某种分析方法的试剂 或试剂盒进行综合评价 (2)对不同实验室的分析工作 质量进行比较,质量控制样品 质控的“标准系统”质控血清(QC)要求：1 QC样品与待测样品性质相同 2 QC样品与待测样品中待测物相同，免疫活性一致 3 QC样品中待测物量已知，分高、中、低三档浓度 4足量制备，分装，低温存放，分批使用制备方法：1按三档浓度收集多余病人血清，测定标示值 2在缓冲溶液中加入无待测物的蛋白质，再溶入 三档浓度待测物标准品，测定标示值使用方法：QC样品组数待测样品总数 / 3 以组为单位在待测样品中前、中、后放置测定,质量控制

13、指标1灵敏度 能检测出与B0管具统计差别的最小可测量 (1)B0%-2SD的相应剂量 (2)B0%-10%的相应剂量 (3)由精密度图得出2特异性 抗体识别其抗原的能力，用交叉反应率表示3精密度 在相同条件下，对某一样品多次检测所得结果的 符合程度，评价随机误差 ( Xi X )2 |X1 X2| SD = n=2时，SD = n 1 2,4偏差 测定值偏离真值的程度，评价系统误差 准确度 测定值与真值的符合程度，评价系统误差和随机误差 测定值 - 真值 偏差b = X 100% 真值 准确度 = 偏差2 + 精密度2 = b2 + SD25稳定性 批间的重复性 B0%、NSB%、ED25、E

14、D50、ED75、QC样品测定值6临床有效性 一项分析方法完成临床目的的程度 正常值及其范围、正常值与异常值交叉范围、 诊断符合率(阳性率、阴性率、假阳性率、假阴性率),实验室内部质量控制方法1对实验数据进行审核剔除“坏点”2剂量反应曲线拟合及质量审核3精密度评价 (1)反应误差关系RER 从多批实验资料求出直线方程式 SDR = a + bR a反映分离误差 b反映加样误差(2)精密度图(P-P图) (用剂量反应曲线) 通过RER将SDR转换SDD(CVD%) 作SDD (CVD%) - lgD曲线CVD%10%,4偏差与准确度评价 (1)回收实验 反映偏差 测定值-空白值 回收率% = X

15、 100% 已知值 回收率% = 100% 10% (2)健全性试验 用标准品和样品分别作剂量反应曲线和样品稀释曲线，两条曲线应平行 (3)二样本-Youden图 反映准确度，用QC样品 QC首-QC尾曲线，误差2SD,5稳定性评价 批间质控，用QC样品 (1)Cusum图 每批QC测定值与靶值的差累计后按 批次连续作图，折线两端落差5SD (2)质控图 QC测定值-批次曲线，误差3SD,评价 1 三种浓度2SD， 但3SD，双向 随机误差大 3 三种浓度中一种3SD， 两种2SD， 三种1SD，单向（或） 系统误差大,免疫放射分析(IRMA),基本原理1 IRMA反应式 (1)单位点 Ag

16、+ *Ab Ag-*Ab + *Ab SP-Ag Ag-*Ab + SP-Ag-*Ab (2)双位点 SP-Ab1 + Ag SP-Ab1-Ag *Ab2 SP-Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2 SP：表示固相,2 IRMA数学函数式 k1 Ag + *Ab Ag-*Ab k2 P + Q PQ P = Ag P0 = Ag0 Q = *Ab Q0 = *Ab0 PQ = Ag - *Ab = B k1 PQ PQ K = = = k2 P Q (P0 - PQ) (Q0 - PQ) B = 展开重排 (P0-B) (Q0-B) B2 B (P0 + Q0 + 1/K ) + P0 Q0

17、= 0,3 剂量反应曲线,方法分类1 双抗体夹心法 （1） SP-Ab1 + Ag SP-Ab1-Ag *Ab2 SP-Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2 （2） Ag + *Ab2 Ag-*Ab2 + *Ab2 SP-Ab1 SP-Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2 （3） SP-Ab1+Ag+*Ab2 SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2,2 标记第三抗体 SP-Ab1 + Ag + Ab2 SP-Ab1-Ag-Ab2 *Ab3 SP-Ab1-Ag-Ab2-*Ab3 *Ab3：第三抗体（抗抗体），为兔（豚鼠） 抗小鼠IgG抗血清 优点：通用性标记抗体,3 双标记抗体法 *Ab2 *A

18、b2SP-Ab1 + Ag SP-Ab1-Ag SP-Ab1-Ag *Ab3 *Ab3 优点：放射性比活度提高，就提高了方法的灵敏 度和精密度,影响免疫放射分析的主要因素1被测抗原的性质 双位点IRMA要求被测抗原有两个以上的 结合位点，方法局限于多肽和蛋白质抗原的分析2结合在固相抗体上的抗原稳定性 被结合的抗原数量较多 时，抗原从固相抗体上分离的倾向更明显 高浓度的准确度较低浓度差3反应时间和温度 室温或4C，24h；37C，1.5-3h4标记抗体的浓度 标记抗体，测定范围，NSB5固相物的洗涤 洗涤，CPM，洗涤，CPM6血清等的非特异性效应 温度，血清效应,IRMA反应管类型 组 类型

19、基本反应试剂 分离 别 名称 常用符号 Ag *Ab 试剂 总放射性管 T - - 标准 非特异结合管 N(S0) - 曲线组 最大结合管 Bmax(Smax) 标准管 Si 样品组 样品管 U 质控组 质控管 QC ,数据处理1 B% - D 曲线2 B% -LogD 半对数“S”曲线3 B/BMAX% - LogD 半对数“S”曲线4 CPM - LogD 半对数“S”曲线，一定范围为直线5 五参数Logistic模型 曲线6 三参数单位点质量作用模型 曲线,标准曲线,免疫放射分析的特点1示踪剂 标记抗体，即蛋白125I标记，标记容易，放射性比活度高2反应动力学 标记抗体是过量的，所以反应

20、速度比RIA快3灵敏度 灵敏度比RIA高12个数量级（10100倍） 4特异性 固相抗体和标记抗体为McAb，特异性更高5标准曲线的工作范围 K相同时，标记抗体，测定范围，NSB 抗体相同时，K，斜率，测定范围，曲线对称性 K和抗体选择得当，工作范围(3个数量级)比RIA(2个数量级)宽6倍以上6方法的稳健性 方法稳定，批内、批间误差小 K对剂量反应曲线的影响：当Ab1/K，影响小 Ab过量，K受温度（4C37C）的影响小 加样误差小，Ab过量，只有加Ag时要注意,RIA与IRMA原理比较 RIA IRMA 竞争性 非竞争性 *Ag *Ab *Ag、Ag、Ab Ag、*Ab Ab限量 Ab过量 B-D呈负相关 B-D呈正相关 反应达平衡慢 反应达平衡快 NSB影响高剂量区 NSB影响低剂量区,非放射性标记免疫分析技术,1 酶免疫分析(EIA、ELISA、EMIT) 2 化学发光免疫分析(CLIA、CLEIA、ECLIA) 3 时间分辨荧光免疫分析(TrFIA) 4 半抗原标记免疫分析 5 免疫PCR,