神经生物学常用研究方法2012.ppt

1、常 用 形 态 学 研 究 方 法,讲授提纲,组织材料的处理一般染色方法免疫组织化学原位杂交神经细胞培养,I 组织材料的处理,1.固定(fixation) 目的： 防止组织自溶，保护组织免受微生物侵袭，保存组织成份不被破坏丢失，维持组织结构使之正确的反应生活状态。 固定剂：4%多聚甲醛（常用） 方法：浸泡固定，灌注固定2.切片(section)： 石蜡切片，冰冻切片,II 一般染色方法,一、尼氏染色方法(Nissl staining)： 1. 定义： 是用碱性染料染神经组织的一种方法，神经组织中可与碱性染料结合的主要成份是核酸，神经元胞体中有大量核糖核酸，主要以尼氏小体的形式存在。细胞核中染色

2、质少，故染色浅，但有明显的核仁。神经胶质细胞的核中染色质较多，着色较深，但胞浆不着色。电镜下尼氏小体是许多规则平行排列并相互够通的粗面内质网以及其间的游离核糖体组成。,2.用于尼氏染色的常用染料有： 焦油紫（cresyl violet） 硫堇（thionine） 甲苯胺蓝 (toluidine blue)3.焦油紫染色法: 石蜡切片或冰冻切片 0.1%焦油紫染液 375-10min 蒸馏水洗 70%Alc 3min 95%Alc 3min 100%Alc 1min3次 二甲苯5min 2次 封片。 结果:尼氏小体紫色，本底无色。,DLG,DRG,Cresyl violet staining,二

3、、高尔基技术(Golgi technique),The Golgi (and related) methods work by staining tissue with silver nitrate which is then reduced to silver. This produces uniform dark coloring of the whole neuron . The morphology of dendrites and axon can be studied in detail.,Cerebellum cortex neuron,cerebral cortex,三、神经束

4、路示踪,1.定义： 利用轴浆运输现象追踪神经元之间联系的一种方法。2.示踪剂： 辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP ） 生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine,BDA） 神经生物素（neurobiotin） 核黄（nuclear yellow） 荧光金（fluorogold） 固蓝（fast blue）,（一）HRP Tracing Experiment,1.HRP的引入：压力注射法，电泳法，缓释法2.Survial time：（束路长度 毫米/350毫米）+1日3.Fixation and Section4.Incubati

5、on Procedure: a.wash sections briefly in three changes of PB b.move the sections to the incubating medium (0.2%DAB,1%H2O2) kept at room temperature for 30-40min. c.wash three times in PB for stop the reaction. d.mounting and observation.,HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat,10,40,（二）荧光

6、染料示踪法,1.荧光染料的配制：2.荧光染料的注射：3.动物存活期：一般存活2-4天。4.灌注固定、取材、冰冻切片。5.贴片后荧光显微镜观察：荧光容易褪 色，贴片后应立即观察。,Fast blue labelling neurons,DRG,Spinal cord,20,20,Superior cervical ganglion of the rat showing a vasoconstrictor neuron labelled with Fast Blue injected into the masseter muscle. Section immunolabelled for NPY

7、(green) and calbindin (red),Rat facial motoneurons revealed with three neuronal tracers, blue - fast blue, red - dextran rhodamine, yellow - fluoro gold,四、NADPH-diaphorase组织化学染色法,1.NO(nitric oxide)的生物合成： 催化NO生物合成的酶称一氧化氮合酶（NO synthase, NOS), NOS以L-精氨酸（L-arg)和分子氧为底物，消耗1.5mol NADPH和2mol分子氧生成NO和L-瓜氨酸。 N

8、ADPH:nicotinamide adenin dinucleotide phosphate Diaphorase:黄递酶 在神经系统大部分区域NADPH-d组织化学染色和NOS免疫组织化学染色一致。,2.NOS与 NADPH-d活性的比较,Nos活性：a.协同因子有Ca2+、CaM、NADPH阻断任何一个协同因子结合位点都可抑制Nosb.底物:L-ArgNADPH-d活性:a.不需CaM、Ca2+作为协同因子，只需NADPHb.底物：NBT(亚硝基四唑氮蓝）,NOS活性NADPH-d活性,使用NOS抑制剂后不能用NADPH-d组化染色来分析NOS活性。NADPH-d组化染色阳性细胞中可含有

9、NOS,但不能说明有NOS 活性，NADPH-d组化染色阴性细胞中一般不含NOS.,3.NADPH-d组化染色步骤,a:冰冻切片b:0.05M Tris缓冲液漂洗c:于含0.2%Tritonox-100的Tris缓冲液中室温 下预孵育510min.d:在含0.3%Tritonx-100,1mg/ml NADPH,0.5mg/mlNBT的Tris缓冲液中37、 孵育11.5小时. e:Tris缓冲液漂洗，中止反应。,NADPH-d Staining In Caudate Nucleus,40,NADPH-d staining,nNOS-ir,40,40,III、免疫组织化学(Immunohist

10、ochemistry),1.定义： 利用特异性抗体对神经组织中某种特异成份(抗原)进行抗原-抗体反应,达到检测组织细胞内是否有此特异性物质.其本质就是用标记的抗体追踪抗原(以确定组织细胞内的某种化学物质).,2.原理,3.Immunohistochemical procedures,（1）Tissue preparation:perfusion,section（2）Blocking:封闭，异种蛋白质间会有非特异性结 合，常用正常羊血清（NGS）或牛血清白蛋白 （BSA）封闭。（3）Incubate in primary antibody:最佳浓度需摸索， 为提高抗体向组织内穿透，可在抗体稀释液

11、中 加入0.1%0.3%TritonX-100。需长时间孵育 时应加入0.01%0.3%NaN3防腐。 产生一抗的动物一定要知道，以便选择二抗。,（4）Washing:去掉非特异性结合（5）Incubate in second antibody :浓度 1/100200,二抗必须针对一抗动物种属， 二抗上结合的物质不同，显色用不同方 法：ABC，PAP，荧光显色，IGSS。ABC PAP经典、产物稳定，荧光法不需三抗， 不需脱水透明。但荧光易淬灭。IGSS非 常敏感，不用DAB做反应，但背景难以 控制。（6） Washing:去掉非特异性结合,（7）加ABC复合物（avidin-biotin

12、complex) or PAP复合物（ peroxidase-anti- peroxidase complex)孵育， 浓度 1:100（或200）。（8）React with DAB: DAB能致癌，在强光下可氧化（应尽 量避光），68分钟出现阳性产物， 镜下控制反应。,4.对照实验,(1)阴性对照： a.NGS 或缓冲液代替一抗 b.去二抗 c.吸附实验：一抗加入后，再加入相应抗 原，将抗体与过量的抗原一起孵育一段 时间后，此混合液再作免疫组化染色(2)阳性对照：,(3)实验步骤PBS洗片 0.5%3%H2O2 15min(灭活内源性过氧化物酶) PBS洗片 5-10%NGS(或510%B

13、SA)+0.2%TritonX-100 孵育12h( 封闭) 一抗4过夜 PBS洗片5min 3次 二抗24h室温 PBS洗片5min 3次 ABC 12h PBS洗片10min 3次 DAB显色,5.应 用 与 评 价,（1）应用： a.用已知抗体探测未知抗原：受体、酶、 递质、 肽类、细胞骨架蛋白等。 b.示踪:示踪物抗体与示踪物反应。 c.用已知抗原探测未知抗体。 d.原位杂交的后续部分。（2）结果评价: a.有阳性产物，说明细胞内有此物质，但是否由此 细胞产生不能完全肯定。 b.定量:阳性细胞数、 灰度值或光密度值。,GAP-43-ir neurons in spinal cord,N

14、S group,Anti-BDNF group,20,20,40,40,40,40,TH-ir,ChAT-ir,GAD-ir,GABAAR-ir,GFAP revealed with ALEXA FLUOR 488 and S100 beta revealed with ALEXA FLUOR 594 in chicken tangentil vestibular nucleus,GFAP-ir,P75-ir,40X,40X,IV 原 位 杂 交(IN SITU HYBRIDIZATION),1.定义： 原位核酸分子杂交技术（In situ nucleic acid molecular hyb

15、ridization)简称原位杂交技术。是用标记的NDA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内待定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。,2.基 本 原 理,根据碱基互补配对原则：待测mRNA: 探针(probe): digoxin-AGTCTAGT- + -UCAGAUCA- 一定温度、时间与条件 -AGTCTAGT- -UCAGAUCA- + digoxin抗体 digoxin 碱性磷酸酶-AGTCTAGT- -UCAGAUCA- 碱性磷酸酶 digoxin digoxin抗体 + NBT 显色,3.探针的类型,

16、（1）cDNA probe：杂交反应有较高的专一性。因其 为双链结构，需加热变性解链。解链后只有半 数DNA链与特定的mRNA杂交，另一半DNA链则 与mRNA竞争，并导致DNA链的自我“退火”（既 重新形成双链）。（2）mRNA probe（互补的RNA）：为单链结构，杂 交反应专一性高，杂交链稳定，制备复杂。（3）Oligonucleotide probe:由DNA合成仪合成，制 备简单，由于链不长，又是单链，较易穿过组 织，操作方便，但杂交链因其链短而不够稳定。,4.Procedures of In Situ Hybridization,（1）Preparation of tissue:

17、 a.组织取材：尽可能新鲜，由于组织RNA降解较快，新鲜组织和培养细胞最好在本30min内固定。取材时应戴手套，防止外源性RNA污染。 b.固定：4%多聚甲醛，灌注固定时固定剂的用量一般为动物体重的2倍，浸泡固定时，组织与固定剂的体积比不低于己于1:10。 C.切片：冰冻切片或石蜡切片。,（2）prehybridization treatment,增强组织的通透性和探针的穿透性：a.稀酸和酸酐(0.2N HCL,0.25%acetic anhybdride)处理：防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合。b.去污剂(0.010.3%TritonX-100)处理：增强组织的通透性，利于探针进入组织

18、细胞。c.蛋白酶(proteinase K)处理:消化包围靶核酸的蛋白质，使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。,（3）Prehybridization,杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育一定时间，以阻断标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到降低背景的目的。 为防止外源性RNA酶污染，杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一天置高温（180）烘烤，杂交前及杂交时所用的溶液均需经高温消毒处理。,（4）Hybridization,a.cDNA探针需变性解链：95100，510min，探针变性后要马上进行杂交反应。b.杂交液：除含一定

19、量的标记探针外，还含有较高浓度的盐类（高度Na+可使杂交率增加，减低探针与标本之间的静电结合）；甲酰胺（可使杂交温度降低）；硫酸葡聚糖（能与水结合，减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度）；BSA、载体DNA与RNA（变性鲱鱼精DNA、酵母转运RNA）（阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，减低背景）。,c.杂交温度：,当杂交液含50%甲酰胺，盐浓度为0.75mol左右时,cDNA探针杂交温度约为42,mRNA探针为5055,寡核苷酸探针约为37D.杂交时间:一般为1620h,杂交反应时间不要超过24h,反应时间过长,形成的杂交体会自动解链,杂交信号反而减弱,（5）杂交后处理:,系列不同浓

20、度、不同温度的盐溶液的漂洗，除去未参与杂交的过剩的探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合。,（6）杂交体的检测：,非放射性核酸杂交，可用酶检测系显色（同免疫组织化学）,5.原位杂交的对照,（1）阳性对照 a.已知阳性组织对照 b.Northern或Southern印迹反应 c.免疫组织化学（2）阴性对照 a.已知阴性组织 b.正义RNA(Sense RNA)探针 c.省去探针 d.杂交前用RNA酶或DNA酶处理标本 e. 检测系统的阴性对照,GAP-43mRNA positive neuron in spinal cord 10,NS group,Anti-BDNF group,The e

21、xpression of synapsin 1 mRNA in the spinal cord anterior horn,40,a,b,Fig. a The expression of c-ret mRNA in the dentate gyrus of rat hippocampus Fig. b The expression of synapsin 1 mRNA in the CA3 region of rat hippocampus,10 ,10 ,V 神经细胞培养,神经细胞的分离培养于1956年由Nakai首创，利用机械的或酶学的方法将神经组织分散为相互分离的单个细胞，然后把细胞悬液

22、用于体外培养。,1.材料的来源：一般取材于胚胎动物的神经组织。2.神经元体外培养液：20%小牛血清或胎牛血清 + DMEM/F12 。3.有丝分裂抑制剂：阿糖胞苷、5-氟脱氧尿嘧啶常用。4.神经元的无血清限定培养液：N1、N2、N3。5.神经元体外培养的生长基质：多聚赖氨酸、多聚鸟氨 酸、鼠尾胶原等。6.体外培养神经元的化学标志物：MAP-2、NF、NSE等。7.神经元体外培养的存活时间：一般地1-2周。,The culture neurons of hippocampus,Cultures DRG neurons, immunostainted with Lrrt,MAP-2-IR of cultured hippocampal neurons,NF-200-ir of cultured hippocampal neurons,40,40,NF-200-ir of cultured spinal cord neurons,Synaptophysin-ir of cultured spinal cord neurons,40,40,THANKS,