1、分光光度计的使用,主要内容,、分光光度法的概念、分光光度计的结构与原理、分光光度计的使用、实验操作（CuSO4溶液标准曲线的绘制）,分光光度法的概念,分光光度法：是利用物质特有的吸收光谱，进行物质鉴定及测定其含量的一种分析技术。也称为吸收光谱法。是光谱分析技术中最常见的一种，应用最多的是紫外及可见分光光度法。特点：灵敏、精确、快速和简便。应用：生物化学微量物质定量分析测定研究中广泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。 光谱范围：2001000nm 。,分光光度法的概念,红外分光光度计:大于760 nm的红外光区 可见光分光光度计:400760 nm的可见光区紫外分光光度
2、计: 200400 nm的紫外光区,分光光度计的分类,722E可见分光光度计,722E可见分光光度计,分光光度计的基本结构,光源,单色光器,吸收池,检测 系统,钨丝灯氢灯氘灯,棱镜衍射光栅,玻璃比色杯石英比色杯,硒光电池光电管光电倍增管,当一束单色光透过溶液时,部分被吸收,部分被反射,部分被透过,Ir,Ia,I,出射光,I,比色皿 吸收杯,反射光,Ir,Ia,吸收光,分光光度计基本原理,/ I0表示光线透过溶液的程度,称为透光度,用T表示；IgT表示溶液对光线的吸收程度，用吸光度（A）表示。即,L ,Lambert-Beer定律（光吸收定律）,Lambert定律：AK1L Beer定律：AK2
3、C Lambert-Beer定律：当一束单色光垂直通过一均匀的溶液时，溶液的吸光度A，与溶液的浓度C及溶液的厚度L成正比。即AKCL其中：A吸光度 K为消光常数，表示物质对光线吸收的能力，受物质种类和光线波长的影响 C溶液的浓度 L溶液的厚度,Lambert-Beer定律的应用,1、利用标准管计算测定物的含量 用一已知浓度标准溶液和一个未知浓度的待测溶液同样处理显色，测定吸光度，根据Lambert-Beer定律得：A1=K1C1L1 A2=K2C2L2 因为 K1=K2 L1=L2 所以,C2=,Lambert-Beer定律的应用,2、利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列已知浓度的测定物溶
4、液，按要求方法处理显色，在最大吸收波长（max）处读取各管的吸光度，以各管吸光度A为纵坐标，对应浓度C为横坐标，作标准曲线。以后进行测定时，待测样品以相同条件在max处读取吸光度，从标准曲线上即可查得该待样品的浓度。,0,722E分光光度计使用,基本操作：（示教） 通电仪器自检（ BLA ） 预热20min 设定波长方式设定（MOOD T（或A） 仪器调“0.000”(将遮光杯）置入光路，在T方式下按“%T”键， 仪器自动校正后显示“0.000 参比液调“0.000”A 样品测定读取“A”。,722E分光光度计使用,注意事项：1、预热-保证仪器准确稳定；2、比色皿的清洁-待测液润洗、冲洗；3、比色皿配套-比色皿不能随意；4、比色皿内盛液体量- 2/3 ，有液体，应用擦镜纸拭干，以保证光路通过时不受影响；5、拿放比色皿-应持其“毛面”，杜绝接触光路通过的“光面”；6、溶液浓度要适当：吸光度读数处于0.10.7范围内为宜，否则误差较大，要适当调整浓度。7、分光光度计连续使用一般不超过2h。,实验操作,实验内容：CuSO4溶液标准曲线的绘制操作步骤：1、用30%CuSO4溶液配制10%、15%、20%、25%、30%的CuSO4溶液各6ml,(1.12.2 ）2、以波长580nm，测定A值；(蒸馏水调零）3、以浓度（C)为横坐标，以A值为纵坐标绘制曲线,
