色谱分析-仪器.ppt

1、赵龙山 分析化学教研室,色谱分析,高效液相色谱仪,一、液相色谱仪器,三、流程及主要部件,（一）高效液相色谱仪的组成部分,贮藏罐与流动相脱气高压泵和梯度洗脱系统进样装置色谱柱与柱温箱检测器色谱数据处理系统,贮液罐与流动相脱气,1.贮液罐耐腐蚀性0.52 L高于泵体密闭溶剂经0.45m滤膜除机械杂质输出流动相管路插入一端连接在孔径过滤器的贮液瓶中,流动相,流动相选择,流动相前处理-过滤,流动相前处理-脱气,过滤：0.45 m或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液,脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡,进样器：平头进样器。预柱：保护色谱柱。尤其是

2、中药和生物样品，必须使用。可以反冲。色谱柱：按照流动相流动方向安装。安装后检查是否漏，用滤纸（观察柱压）。要观察废液缸流出的流动相体积。检测器：按照需要选择。记录系统：按照需要选择。,高压输液泵及梯度洗脱装置,高压输液泵要求：1.泵体耐腐蚀 2.能在高压下连续工作 3.输出流量范围宽 4.输出流量稳定，重复性好类型：1.恒流泵：输出恒定体积流量流动相 注射泵（螺旋泵） 柱塞式往复泵 2.恒压泵（气动放大泵）：输出压力恒定，系统阻力不变时流量恒定；系统阻力改变时流量不恒定。,高压输液泵可分为两类：恒流泵和恒压泵。恒压泵： 主要指气动放大泵，泵出口压力在系统中是恒定的，流速由柱的阻力决定。恒流泵：

3、 包括往复柱塞泵和螺旋柱塞泵，这类泵输出的溶剂流量是恒定的，柱前的压力由柱后的 阻力及系统气密性决定。恒压泵和恒流泵是指这两种泵的工作原理，并不表明泵的操作方式。借助于电子控制电路，往复泵和柱塞泵也可以按恒压方式操作。唯有气动放大泵只能恒压操作。,三、高压输液泵,1. 气动放大泵气动放大泵是根据压力传递原理而设计的。气动泵有两个界面，气体推动的截面大，推动溶剂的截面小。由于截面两端压力相等，则输出截面的压强正比于两个截面的比值。只要这种比值足够大，则输出的溶剂可以获得很高的压力。,气动放大泵示意图,2. 往复柱塞泵 目前作为商品出售的高压恒流泵多为往复柱塞泵。在电机驱动下，柱塞杆在泵头内作作线

4、性往复运动，完成将流动相吸入泵头然后再输出的过程。(1) 工作过程在吸液过程中，由于柱塞的运动而在泵腔内形成负压。此时由于色谱柱的存在，泵头外的压力显然高于泵头内，在这种情况压差下，出口单向阀的宝石球落回到阀座上；而入口单向阀因为外界大气压大于泵腔内的压力，宝石球离开阀座，流动相顺利地进入泵腔,在输液过程中，由于柱塞杆的运动使压力增加，入口单向阀的宝石落回到阀座，入口单向阀处于关闭状态；当泵头的压力继续增加，并且超过了泵头外的色谱柱的反压时，出口单向阀开启，流动相输出。,(2) 往复柱塞泵的特性往复柱塞泵每往复一次输出的流量由柱塞的截面积和冲程决定。单位时间输出的液体流量由单位时间内柱塞往复的

5、次数决定。往复泵可以连续不断的以恒定的流量输送液体，同时更换溶剂非常方便，特别适用于梯度洗脱的需要。往复泵的缺点在于柱塞是往复运动地，输出流量和泵压力有波动性。在系统压力过高时有反吸现象。(3) 多头往复泵 为降低液体输送过程中所产生的脉动，最有效的方法是采用多头往复泵，由专门设计的驱动装置保证在任一瞬间都有液体输出，以降低波动。,双柱塞往复串连泵(HP 1100),双柱塞往复并联泵(HP1090),(4) 四元泵（单元泵）（HP1100）,四元泵（单元泵）属于双柱塞往复串连泵。四元泵启动时，通过运行一个初始程序来决定第一个活塞能到达的最高位置。第一个活塞慢慢向上移动至最高位置，然后从那向回移

6、动一个预定的路径长度。控制器将这个活塞位置存贮在记忆中。完成初始化后，泵开始设定参数的操作。主动阀打开，向下移动的活塞将溶剂吸入第一个泵头，与此同时，第二个活塞向上移动，将溶剂送入系统。在完成一个由控制器决定的冲程长度后，驱动马达停止，主动阀关闭。马达反方向反转，移动第一个活塞向上至最高位置，同时移动第二个活塞向下。,(5) 二元泵,二元泵是指一个泵腔内含有两个相同的泵，它通过高压混合产生梯度，二元泵不包括真空脱气装置，但真空脱气机可以作为单独的产品定购，在需要最好的流动稳定性时使用，特别是在低流速或最大检测灵敏度时。二元泵中每个泵的工作原理与四元泵（单元泵相同）,3.螺旋柱塞泵因其工作原理与

7、注射器类似，也称为注射泵。螺旋柱塞泵和往复泵的原理完全不同。电机以一定的转速通过螺杆旋转驱动柱塞上下移动。柱塞向下移动时，将液体吸入缸内，一次吸入数十毫升，可快速进行。柱塞向上移动时将液体排出。流量通过电机转速控制。,1,2,3,4,5,6,7,1溶剂出口 2三通阀3溶剂入口 4溶剂室 5活动密封 6螺旋推动柱塞 7转速驱动装置,梯度洗脱装置,梯度洗脱是使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相组成，以调节流动相极性。 梯度洗脱技术的优点是:可提高柱效、缩短分析时间，也可改善检测器的灵敏度。当样品第一个组分的k和最后一个峰的k相差几十倍至百倍时，采用梯度洗脱效

8、果最好。此技术与气相色谱法中的程序升温相似。梯度洗脱方式有两种：低压洗脱和高压洗脱,低压梯度洗脱系统： 常压下将溶剂按程序混合，用一台高压泵送入色谱柱高压梯度洗脱系统： 两台高压泵将溶剂增压后送入梯度混合室混合，再送入色谱柱,四、梯度洗脱装置 根据溶剂混合的原理不同，梯度洗脱装置可分成两类：低压梯度和高压梯度,1.低压梯度洗脱（泵前混合）,低压梯度：溶剂在常压下混合，然后用一个高压输液泵把混合液输送至系统中。方法简单、经济，而且只需一个泵，所用溶剂元数没有限制（一般最多为四元）。,2. 高压梯度（泵后混合）,高压梯度：溶剂首先经过高压泵加压，然后在混合室内混合。高压梯度一般使用两台高压输液泵，

9、每台输送一种溶剂。,进样系统,在液相色谱中，进样方式有三种：柱头进样，六通阀进样，自动进样。三种进样方式中，最理想的进样方式是柱头进样，但由于实践起来困难很大，因此在常规分析中主要采用六通阀进样或自动进样。一、六通阀进样,2.自动进样器 自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按标准编制注射样品的操作程序工作。取样、进样、样品管路清洗和样品盘的转动均按预定程序自动进行，一次可进行上百个样品分析。,2. 自动进样器,Mainpass,Bypass,Loading,Inject and Run,柱材料及规格1.柱材料：内壁抛光的不锈钢管2.柱规格：直型。内径4.6mm或3.9mm；长度1050cm柱温

10、控制 用柱温箱控制柱温。,色谱柱,色谱柱的测试与维护,商品柱都附有测试条件和报告。色谱柱使用过程中的注意事项（1）仪器与柱子连接时，不要用力过大。（2）进样前，样品要处理。（3）更换流动相时，根据流动相性质选择合适的溶剂冲洗仪器和色谱柱，防止流动相不相溶或盐析出，堵塞柱子。（4）柱子存放过程应密闭，防止固定相干燥，定期冲洗。,色谱柱的选择,色谱柱的使用,流动相：高纯度、过滤、 pH范围、 有机溶剂与色谱柱匹配 互溶、并能溶解样品净化样品3. 使用保护柱：与色谱柱填料、内径一致避免色谱柱污染, 拧三圈！退一圈！,（二）检 测 器,检测器是高效液相色谱仪中的三大部件之一（高压输液泵、色谱柱、检测器

11、），主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓度变化。 检测器应具备如下特征： 灵敏度高 对组分的响应速度快 响应对流动相流量和温度变化不敏感 不引起柱外峰展宽 线性范围宽；使用范围广,检测器,检测器的作用是将从色谱柱中流出的物质量的变化，转变成可供观测或检测的信号，通常为电压信号。该信号再通过记录仪、积分仪或色谱工作站等进行色谱数据处理。 对于液相色谱而言，由于待分离样品的所有组分均溶于流动相中而处于液相状态，样品与样品、样品与流动相之间各种物理性质接近，因此要寻找出一种即通用又灵敏的检测方法比较困难，至今为止检测器的技术问题仍然是HPLC中的薄弱环节。,HPLC中使用的检测器种类1. 按检测器用途

12、分类：检测器可分为通用型检测器（加和性质）和选择性检测器（溶质性质）。通用型检测器是利用连续测定色谱柱流出物质某些具有普遍性的物理参数如折光指数、介电常数等而设计的检测器。根据吸馏液（样品与溶剂的混合物）与溶剂相同性质的差别检测被分析物质。这种检测器具有广泛的适用性，但灵敏度低，容易受外界因素如温度、流速、流动相组成等的影响，因此限制了使用范围。选择性检测器是利用测定某些物质特有的性质如紫外吸收、荧光等而设计的检测器，一般来说其灵敏度要比通用型检测器的灵敏度高102103倍或者更高，并且受外界因素包括流动相的组成变化影响极小或者没有，但是在使用上仅限于测定对检测器有相应的物质。,检测器,2.

13、按检测器测量性质分类：检测器可分为浓度型检测器和质量型检测器。浓度型检测器是连续测定样品溶液的浓度变化，是反映总体性质的检测器，例如紫外、荧光 或示差检测器就属于此类。质量型检测器是测量样品的总量，库仑、同位素或质谱检测器就属于这一类。,检测器,3. 按测量原理分类：检测器可分为光学检测器和电学检测器。由于检测器是影响色谱中的薄弱环节，所以世界各国在研究开发方面投入了大量的精力和财力。从目前发表的文献统计数据来看，光学检测器（包括紫外、示差、荧光检测器等）的应用占绝对多数，随着二极管阵列检测器的推广和应用，这一比例还会增加。其次发展速度较快的是电学型检测器（例如电化学、电导检测器等）。另外各国

14、也正在积极地开展HPLC与IR、MS、NMR等的联用技术。,检测器,HPLC检测器的性能指标,噪声与基线漂移灵敏度检测限（定量限）线性范围定性定量重现性检测器的池体积,各类HPLC检测器介绍,紫外检测器（UVD） 紫外检测器是高效液相色谱仪使用最广泛的一种检测器，它分为： 1.固定波长紫外检测器 2.可变波长紫外检测器 3.光电二极管矩阵检测器,1.固定单波长式紫外检测器光源：低压汞灯检测波长：固定于254nm灵敏、稳定、方便、经济,检测器结构（可变波长检测器）,可变波长检测器采用氘灯作光源，波长在190600nm范围可调。光源发出的光经过透镜聚焦在入口狭缝上，光透过狭缝经过反射到达光栅，光栅

15、把190600范围的光分成不同波长的单色光后，把某一波长的单色光经过平面镜反射至光分束器。透过分束器的光经过样品池最终到达样品光电二极管检测器倍检测；被光分束器反射的光到达参比检测器被检测。紫外检测器的这种设计，使得它在某一时刻只能采集某一特定波长。为了对色谱过程中各个峰都获得最灵敏的检测，光栅可以编程控制，便于采集过程中变化波长。紫外检测器适用范围 紫外检测器不是通用型检测器，可以检测有键及非共用电子对的物质，如烯烃，芳烃以及含CO，CS，NO，NN基团的化合物，这些化合物在紫外区都有吸收。,可变波长紫外检测器可以认为是微量流通池来代替紫外/可见分光光度计的样品池。光源：D2灯/W灯检测波长

16、：185400nm，或400600nm任选灵敏、通用性更强当前HPLC仪配置最多的检测器不如单波长紫外检测器稳定噪音水平也相对较大,紫外检测器不是通用型检测器，可以检测有键及非共用电子对的物质，如烯烃，芳烃以及含CO，CS，NO，NN基团的化合物，这些化合物在紫外区都有吸收。,3.光电二极管阵列检测器 DAD与普通紫外检测器的区别在于进入流通池的不是单色光，获得的信号不是在某一波长上的，而是在全部紫外光波长上的色谱信号。因此，它不仅可进行定量检测，还能提供组分的光谱定性信息。,光源经聚光后，直接照射流通池，其透过光经光栅分光，分出的单色光，被光电二极管阵列所接受，每一个二极管接受一个特定波长的

17、信号。经计算机处理，可获得定量定性的色谱光谱信息。,DAD检测器的特点：1.可以获得多个波长的色谱图，因此可以计算不同波长的吸收比。2.可在色谱分离期间，对每一个色谱峰的指定位置记录吸收光谱图。如果每一个色谱峰记录三个位置的光谱图（峰前沿、峰顶点、峰后沿），通过比较三个位置的光谱图，可判别色谱峰的纯度及分离情况。3.在色谱运行期间可以进行逐点光谱扫描，得到的波长-吸光度三维图形，由于每一个组分均有全波段的吸收光谱图，因此可利用色谱保留值规律和光谱吸收曲线综合进行定性分析。,DAD检测器结构,荧光检测器（FD）,原理： 许多有机药物，特别是芳香族药物，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发

18、光波长要长的荧光。 F=Kc（低浓度）特点： 1.噪音较大。 噪音水平：103mV 2.极其灵敏 。最小检测限10-13g/ml 3.线性范围很宽，可达106 4.适于梯度洗脱，受温度影响小 5.可进行定量的浓度型检测器 6.与UVD相比有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度、线性要比紫外检测法高2-3个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。,有紫外吸收的物质可能有荧光。选择最大激发和发射波长，提高灵敏度。使用荧光衍生化试剂，测定没有荧光的物质。适合于生物样品的测定。,检测器结构,从氘灯或氙灯发出的激发光首先聚焦在第一个光栅，此光栅通过转动选择需要的激发波长聚焦在流动池。样品经过激发光的

19、照射后发出荧光，荧光经过聚焦和反射，到达第二个光栅，第二个光栅经过转动选择检测合适波长的荧光反射到检测器检测。使用荧光检测器时，要注意流动相组成对荧光发射的影响。溶剂自身的极性、pH值、氧的含量、溶剂的氢键作用等都会影响荧光的发射强度或发射波长。溶剂中的杂质，特别是氧的含量，可能完全抑制低荧光化合物发射的信号，因而溶剂需要脱氧。,应用范围荧光检测器用于检测能够发射荧光的化合物，但本身具有荧光特性的有机或者无机化合物很少，可以通过衍生的方法使原来不发荧光的化合物发射荧光，进而对其进行检测。下面表格列出某些固有发射荧光的物质。,示差折光检测器（DRD）,示差折光检测器是通过连续监测参比池和测量池中

20、溶液的折光率之差来测定样品浓度的检测器。由于每种物质都有不同的折光率，因此示差折光检测器属于通用检测器。,特点：1.可进行定量分析的浓度型检测器2.噪音很小，噪音水平：10-7mV3.灵敏度很差，最小检测限：10-610-7g/ml4.线性范围较窄，仅为1045.不适于梯度洗脱，受温度、环境条件影响大,示差折光检测器,蒸发光散射检测器（ELSD）,蒸发光散射检测器是20世纪90年代出现的最新型的通用检测器。理论上可用于挥发性低于流动相的任何组分，但由于它对有紫外吸收的样品组分的检测灵敏度较低，因而只要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体类等几十类化合物。这种

21、检测器是示差折光检测器的理想代替品。蒸发光散射检测器的主要缺点：1.对紫外吸收的样品组分检测灵敏度低2.只适用于流动相能够挥发的色谱洗脱,（1）雾化液体流动相在载气压力的作用下在雾化室内转 变成细小的液滴，从而使溶剂更易于蒸发。,（2）蒸发 载气把液滴从雾化室运送到漂移管进行蒸发。 在漂移管中，溶剂被除去，留下微粒或纯溶质 的小滴。（3）检测溶质颗粒从漂移管出来后进入光检测池，并穿过激光光束。被溶质颗粒散射的光通过光电倍增管进行收集。,样品检测分为三步,色谱工作站,色谱数据处理装置,注意事项,1、直接用甲醇置换缓冲液，样品在流动相中产生沉淀2、用水溶性滤膜过滤有机溶剂3、流动相跑空，使得气泡进入流路4、不要用纯水直接冲洗柱子5、溶剂,特别是缓冲液泄漏在仪器内部6、流速变化率太大7、高温使用下的柱子尚未降温就停泵8、阳光直射溶剂瓶或检测器9、空调直吹检测器,