真菌RNA提取试剂盒带gDNA过滤器.DOC

1、北京金百特生物技术有限公司 订货： 010-82796566 Q Q ： 253042134 【 金百特 生物 】 技术支持： 15011185085 www.gene- 真菌 RNA 提取试剂盒 (带 gDNA 过滤器 ) 目录号： R515 适用范围： 适 用于快速提取 真菌 组织细胞总 RNA，使用独有基因组 DNA过滤器 技术可有效 滤除 电泳可见 gDNA残留， RNA可用于反转录 PCR，荧光定量 PCR等。 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 20 次 (R515-20) 50 次 (R515-50) 裂解液 RLT 室温 20 ml 50 ml 裂解液 CLB 室温

2、8 ml 8 ml 裂解液 RLT PLUS 室温 10 ml 25 ml 去蛋白液 RW1 室温 15 ml 40 ml 漂洗液 RW 室温 5 ml 10 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温 10 ml 10 ml PLANTaid 室温 2 ml 5 ml 基因组 DNA 过滤器 DA 和收集管 室温 20 套 50 套 RNase-free 吸附柱 RA 和收集管 室温 20 套 50 套 本试剂盒在室温储存 6 个月不影响使用效果。 储存事项： 1. 不合适的储存于低温（ 4 或者 20 ）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（

3、 15 25 ）进行。 2. 避免试 剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、 PH 值变化，各溶液使用后应及时【 金百特 生物 】 技术支持： 15011185085 - 1 - www.gene- 盖紧盖子。 产品介绍 ： 本公司独家推出无苯酚、氯仿 RNA 快速提取技术基础上，又独家研发成功基因组 DNA 过滤器技术确保有效滤除 gDNA 残留，得到的 RNA 不需要 DNase 消化，可直接用于 PCR、荧光定量 PCR 等实验。 独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞 RNA 酶，然后 裂解混合物通过一个基因组 DNA 过滤器，基因组 DNA 被滤除而 RNA 穿透滤过。滤过的 RNA 用乙

4、醇调节结合条件后 ,RNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速 的漂洗离心的步骤 , 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的 RNase free H20 将纯净 RNA 从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1. 完全 不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 2. 简捷，单个样品操作一般可在 25 分钟内完成 ，世界上最简单快速的试剂盒 。 3. 独有的 真菌 RNA 助提剂可以有效结合多糖多酚 ， 提高 清 除 效果。 4. 独家研发成功基因组 DNA 过滤器 技术可以有效 滤除 gDNA 残留，得到的 RNA 一般不需要 DNa

5、se 消化，可用于反转录 PCR、荧光定量 PCR 等实验。 5. 适应性极其广泛，可以提取包括 棉花、松针、冬青树叶、葡萄叶片、等 100 多种国内外试剂盒提取失败的样品。详细样品列表请参考公司主页产品介绍。 6. 多次柱漂洗确保高纯度， OD260/OD280 典型的比值达 1.9 2.2，基本无 DNA 残留 ,可用于 RT-PCR， Northern-blot 和各种实验。 【 金百特 生物 】 技术支持： 15011185085 - 2 - www.gene- 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成， 使用转速可以达到 13,000 rpm的传统台式离心机，如 Eppendorf

6、 5415C 或者类似离心机。 2. 需要自备乙醇，研钵 (可选 )。 3. 样品处理量绝对不要超过基因组 过滤器 DA和和 RNA吸附柱 RA处理能力 ，否则造成 DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品 DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。 4. 裂解液 RLT和 RLT PLUS 和 去蛋白液 RW1中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套， 避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 5. 关于 DNA 的微量残留 : 一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残

7、留（ DNase 消化也无法做到 100%无残留）， 本公司的 新型 RNA 提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲 体系和 基因组 DNA 过滤器 技术 ， 绝大多数 DNA 已经被 滤除 ，不需要 DNase 消化，可直接用于反转录 PCR 和荧光定量 PCR。个别特殊情况 如 DNA 含量过于丰富造成残留或者 要进行严格的 mRNA 表达量分析荧光定量PCR， 我们建议在进行模板和引物的选择时： 1) 选用跨内含子的引物 ,以穿过 mRNA中的连接区 ,这样 DNA就不能作为模板参与扩增反应。 2) 选择基因组 DNA和 cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。 3) 将 RNA提取物用

8、RNase-free的 DNase I 处理。本试剂盒还可以用于 DNase I处理后的 RNA清洁 (cleanup) ， 请联系我们索取具体操作说明书。 4) 在步骤去蛋白液 RW1漂洗前，直接在吸附柱 RA上进行 DNase I柱上消化处理。购买 DNA酶柱上消化试剂盒 (货号： R314)前可先索取具体操作说明书。 6. 仔细阅读补充说明 2，如果裂解液 CLB效果好，可以联系 我们单独订购裂解液CLB，或者购买试剂盒的时候，指明将裂解液 RLT换成裂解液 CLB。 【 金百特 生物 】 技术支持： 15011185085 - 3 - www.gene- 操作步骤：（实验前请先阅读注意

9、事项） 提示： 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶加入指定量无水乙醇 ! 1. 直接研磨法 （推荐） : a. 新鲜 真菌 组织称重后取 100mg迅速剪成小块放入 研钵 （冰 冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取 100mg 放入 研钵 ） ， 加入 10 体积（ 1ml） RLT 和 1 体积（ 100l） PLANTaid 室温下充分研磨 成匀浆 ，注意应该迅速研磨让组织和裂解液 RLT 立刻充分接触以抑制 RNA 酶活性 。 注： PLANTaid 是提取多糖多酚次级代谢产物色素含量丰富的困难样品不可缺少成分。提取普通 真菌 组织可以不加 PLANTaid， RNA 产量可能会提高一些

10、。 b. 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡 15 秒， 13， 000rpm 离心 5-10 分钟 ,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的 PLANTaid。 c. 取 480l 裂解物上清 （在不超过基因组 DNA过滤器 能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量） 转到一个新离心管。 加入上清体积一半的无水乙醇(0.5 体积 )，此时可能出现沉淀 ,但是不影响提取过程 ,立即吹打混匀 ,不要离心。 d. 立刻接 操作步骤 的步骤 3。 2. 液氮研磨法 （提取复杂，易降解样品时推荐此法） : a. 取 500l 裂解液 RLT，转入 1.5ml 离心管中，加入 50l PLANTaid

11、 混匀备用。 b. 液氮中研磨适量 真菌 组织成细粉后，取 50mg 细粉转入上述装有 RLT 和PLANTaid 的离心管 , 立即 用手 剧烈 振荡 20 秒，充分裂解 。 在 56 温育 1-3分钟有助于裂解 真菌 ,但是淀粉含量高的 真菌 不能温育 ， 因为提高的温度可能导致淀粉膨胀。 c. 用吸头吹打混匀帮助裂解或者剧烈涡旋震荡 直到得到满意匀浆结果 (或者电动匀浆 30 秒 )， 可以剪切 DNA， 降低粘稠度和提高产量。 d. 将裂解物 13,000 rpm 离心 5-10 分钟 ， 沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的 PLANTaid。 e. 取 裂解物上清 （在不超过基因组

12、 DNA 过滤器 能力的情况下可以取更多的上【 金百特 生物 】 技术支持： 15011185085 - 4 - www.gene- 清，这样可以提高产量） 转到一个新离心管。 加入上清体积一 半的无水乙醇 (0.5体积 )，此时可能出现沉淀 ,但是不影响提取过程 ， 立即吹打混匀 ,不要离心。 f. 立刻接 操作步骤 的步骤 3。 注意： 以上液氮研磨法 用户可以根据需要加倍处理，可以提高产量。也就是使用1ml 的裂解液 RLT 和 100l PLANTaid和 100mg 的样品。 3. 将混合物 (每次小于 720l，多可以分两次加入 )加入一个基因组 DNA 过滤器 中，（ 过滤器 放

13、入收集管中） 13,000 rpm 离心 2 分钟，弃掉废液。 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。 4. 将基因组 DNA 过滤器 放 在一个干净 2ml 离心管内（不用 RNAse free 或者 DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用 RNA 吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组 过滤器 内加 500l 裂解液 RLT PLUS， 13,000 rpm 离心 30 秒， 收集滤液（ RNA 在滤液中），用微量移液器 较精确估计 滤过液 体积 （通常为 450-500l 左右，滤过时候损失体积应该减去） ， 加入 0.5 倍 体积的 无水

14、乙醇 ， 此时可能出现沉淀 ,但是不影响提取过程 ,立即吹打混匀 ,不要离心。 5. 立刻 将混合物 (每次小于 720l，多可以分两次加入 )加入一个吸附柱 RA 中，（ 吸附柱放入收集管中） 13,000 rpm 离心 2 分钟 ，弃掉废液。 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。 6. 加 700l 去蛋白液 RW1，室温放置 1 分钟 ， 13,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。 7. 加入 500l 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇 !）， 13,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。加入 500l 漂洗液 RW， 重复一遍。

15、8. 将吸附柱 RA 放回空收集管中， 13,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液 , 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 9. 取出吸附柱 RA，放入一个 RNase free 离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30-50l RNase free water（事先在 70-90 水浴中加热可提高产量）， 室温放置 1 分钟， 12,000 rpm 离心 1 分钟。 【 金百特 生物 】 技术支持： 15011185085 - 5 - www.gene- 10. 如果预期 RNA 产量 30g，加 30-50l RNase free water 重复步骤 9，合并

16、两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍 (如果需要 RNA 浓度高 )。 洗脱两遍的 RNA 洗脱液浓度高 ,分两次洗脱合并洗脱液的 RNA 产量比前者高1530%,但是浓度要低 ,用户根据需要选择。 补充 说明 2： 有一些特别复杂的 真菌 使用裂解液 RLT 提取失败或者产量很低想提高产量的情况下，可以尝试使用裂解液 CLB，裂解液 CLB 是本公司最新研发配方，测试的松针、丹参叶、胡杨叶、番茄叶表明可以提高产量一倍甚至数倍。 附录 2： R515 真菌 RNA 快速提取试剂盒 （带 gDNA 过滤器） 使用新裂解液 CLB 操作步骤 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶加

17、入指定量无水乙醇 ! 取 1ml裂解液 CLB 至离心管内 (如果 CLB 有析出或者沉淀需先置于 65 C水浴 重新溶解） ， 在裂解液 CLB 中加入 2%-巯基乙醇（ 1ml CLB 加 20l -巯基乙醇）。颠倒混匀后 65 C 水浴中预热。 1. 液氮中研磨新鲜或 -70 C 冷冻的材料至细粉。 2. 转移 100-150mg细粉（水分少的 样品如种子 叶片等 可加 100mg，水分多的样品如西瓜可多加一些）加至 预热的裂解液 CLB（已加有 -巯基乙醇 ） 离心管中，立即激烈涡旋 30 60 秒或者用吸头吹打混匀裂解 ，短时放回 65 C 水浴中（ 5 min），中间偶尔颠倒 1-2 次帮助裂解。 -巯基乙醇是裂解液 CLB 的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到 5-10%。 3. 振荡混匀后 室 温 13,000rpm 离心 10 分钟。 4. 取 裂解物上清 （在不超 过基因组 DNA 过滤器 能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量） 转到一个新离心管。 加入上清体积一半的无水乙醇 (0.5体积 )，此时可能出现沉淀 ， 但是不影响提取过程 ， 立即吹打混匀 ， 不要离心。 若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。 5. 立刻接 操作步骤 的步骤 3。