微生物学基本操作技术.ppt

1、微生物基本操作技术,中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC姚 粟,内 容,微生物分类微生物接种和培养微生物的分离微生物的鉴定微生物保藏质控微生物,一、微生物分类,一、微生物分类-微生物的进化和多样性,普遍性系统发育树,亲缘关系根据rRNA序列比较来决定。G. J. Olsen and C. R. Woese, Ribosomal RNA: A key to Phylogeny in the FASEB Journal, 7:113-123,1993,一、微生物分类,原核生物大小: 0.5-3 mm形状:- 球型 (Sthaphylococcus)- 棒状(Escherichia coli)-

2、 螺旋 (Rhodospirillum)生长迅速，20min至几小时可繁殖一代可利用多种碳源,真核生物细胞器：线粒体内质网高尔基体液泡,一、微生物分类,http:/micro.magnet.fsu.edu/cells/animals/images/animalcell.jpg,http:/www.microscopy.fsu.edu/cells/procaryotes/images/procaryote.jpg,原核生物,一、微生物分类,真核生物,一、微生物分类,一、微生物分类-多相分类,表征（表型）特征形态特征生理和代谢特征生态特征遗传（基因型）特征蛋白质比较核酸碱基组成核酸序列,多相分类P

3、olyphasic Texonomy Technology,一、微生物分类-微生物的分类等级,“种”是微生物分类中最基本的分类单元。“种” 的定义：一个种（基因型种）是有相似G+C组成并通过DNA杂交试验判断由70%或更大相似性的菌株的集合。,分类等级界（Domain）门（Phylum）纲（Class）目（Order）科（Family）属（Genus）种（Species）,二、微生物接种和培养,二、微生物接种和培养,微生物接种定义 将微生物的纯种或含菌材料（如水、食品、空气、土壤、排泄物等）转移到培养基上，这个操作过程叫微生物的接种。接种工具 微生物接种技术分类斜面接种液体接种穿刺接种平板接种

4、,二、微生物接种和培养,斜面接种左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平；右手先将棉塞（硅胶塞）拧转松动，再拿接种环；用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上灼烧；接种环灼烧灭菌后插入试管内，冷却、挑菌，转入另一斜面底部，沿斜面划曲线或直线。,二、微生物接种和培养,二、微生物接种和培养,液体接种操作方法与斜面接种基本一致，只是将接种环送入液体培养基中时使接种环与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散；塞上棉塞，轻轻摇动均匀；如果菌种培养在液体培养基中，使用移液管或滴管接种。,二、微生物接种和培养,三、微生物接种和培养,穿刺接种用接种针调取菌种后，插入深层固体培养基内（不要刺

5、到底部），再沿原路拔出；此法用于厌气性细菌接种，检查细菌的运动能力。,二、微生物接种和培养,二、微生物接种和培养,平板接种平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，以及活菌计数等；平板接斜面：平板分散的单菌落接于斜面；斜面接平板：点种法、划线法。,二、微生物接种和培养,三、微生物分离,微生物纯培养分离技术,纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。获得纯培养物对微生物学研究至关重要。,微生物纯培养分离技术,涂布平板法平板划线法平板倾注法稀释摇管法,液体培养基分离法单细胞（孢子）分离法选择培养基分离法,涂布平板法,1、少量样品加到平板中央（0.1mL）；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂

6、棒在火焰上灼烧后使其冷却；4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养。,涂布平板法,样品需适当稀释30-300CFU/mL,平板划线法,斜线法曲线法方格法放射法四格法,平板划线法,斜线法：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿70角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。,曲线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。,平板划线法,血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）,平板倾注法,对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀

7、释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获得单菌落。培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。,稀释摇管法,适合厌氧菌的纯培养分离,无菌琼脂培养基试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50左右,梯度稀释后的待分离菌株加入试管中,摇匀、冷凝,在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物,培养后，菌落形成在琼脂柱的中间,液体培养基分离,不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。,单细胞（孢子）分离,单细胞（或单孢子）分离

8、法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养 。 单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。,选择培养基分离,选择培养基特性促生长能力抑制能力指示（鉴别）能力,选择培养基分离,传统选择性培养基血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制G+细菌，有选择地促

9、进G-菌生长，是较好的弱选择性培养基。麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。,选择培养基分离,新型显色培养基利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的培养基。,选择培养基分离,基于酶与底物反应的显色培养基技术,CHROMagar,Petrifilm 3M,Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plat

10、e Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate,基于酶与底物反应的显色培养基技术,四、微生物鉴定,四、微生物鉴定,多相鉴定（分类)（polyphasic taxonomy）是利用微生物从分子特性到生态特征的多种不同信息，综合表型和基因型特征进行微生物分类鉴定的方法。,四、微生物鉴定-形态学观察,四、微生物鉴定-形态学观察,四、微生物鉴定-生理生化,四、微生物鉴定-生理生化,Division based

11、 on membrane composition:a) gram-negative have outer and inner membranes and a thin cell wall (Escherichia coli) b) gram-positive have no outer membrane, but have a thicker cell wall (Bacillus subtilis)c) neither gram- nor gram+ - no cell walls (mycoplasm),http:/www.med.sc.edu:85/fox/gram-st.jpg,htt

12、p:/www.med.sc.edu:85/fox/bact-mem.jpg,四、微生物鉴定-生理生化,API (bioMerieux)(biochemical),四、微生物鉴定-生理生化,BBL Crystal (Becton Dickinson)将传统的生化反应、酶底物呈色反应与荧光增强显色技术结合，设计鉴定反应最佳组合。六类鉴定试验板，可鉴定500种细菌,四、微生物鉴定-化学成分分析,四、微生物鉴定-基因型分析,G+Cmol% 16S rDNA, 26S rDNA D1/D2, 5.8S rDNA ITS region, -tubulin gene, calmodulin gene, gy

13、rA gene, pheS gene, recN gene, rpoB gene and other housekeeping genes.DNA Barcoding gene sequence analysis, MultiLocus Sequence Analysis (MLSA) DNA-DNA hybridizationRAPD, RFLP, AFLP, SSCP, Eric-PCR, BOX-PCR, Rep-PCR , LAMP.,四、微生物鉴定-基因型分析,假丝酵母PCR-SSCP,副溶血弧菌ERICPCR,沙门氏菌REP -PCR,四、微生物鉴定-鉴定实例1,16S rDNA序

14、列系统发育树,infB基因序列系统发育树,2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表,2008年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov.,2010年 USP将ATCC 16404 更名,2010年 WDCM 将ATCC 16404 更名,图：ATCC 16888和ATCC 16404的培养特征和显微形态anos Varga, Sandor Kocsube , Bea ta To th, et al. Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate bl

15、ack Aspergillus species with world-wide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932,图: Rep-PCR条码系统发育树(DiversiLab平台)Figure 2: Dendrogram of Rep-PCR Barcoding (DiversiLab Platform) .注：图片来源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Asper

16、gillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, Vol. 14 (10): 2-14,表 ITS序列特殊位点碱基差异Table Difference of base position in ITS sequence,四、微生物鉴定-鉴定实例2,2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表,2008年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov.,2010年 USP将ATCC 16404 更名,2010年 WD

17、CM 将ATCC 16404 更名,图: 基于曲霉黑色组-微管蛋白基因序列的N-J树Figure : Neighbour joining tree based on -tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri.注：图片来源于Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution International. Journal of Systematic and Evolutionary Mi

18、crobiology, 2007, 57: 19251932,图1: 基于ITS DNA序列的黑色曲霉N-J树Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS DNA Sequences.注：图片来源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, Vol. 14 (10): 2-14,四、

19、微生物鉴定-鉴定实例2,各种标准中仍将继续采用ATCC 16404作为质控菌株。各类标准中，其它被指定为参考菌株的黑曲霉菌株(CMCC(F) 98003) ,需要重新复核鉴定。,黑曲霉,？,四、微生物鉴定-鉴定实例2,形态学鉴定CYA培养基, 25C培养7 dBiolog鉴定生长浊度试验ITS rDNA区序列分析ITS4: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5: 5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3-微管蛋白基因序列分析Bt2a: 5-GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC-3Bt2b: 5-ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC-3

20、,反应体系：100 L, 10 扩增缓冲液10 L; DNA模板1 L ; dNTP (每种2.5 mmol/L) 8 L; 引物(10 L/L)各2.5 L; Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1.3 L; 无菌超纯水补足总体积100 L。,反应程序：94C 5 min; 94C 1 min, 55C 1 min, 72C 1 min, 30个循环; 72C 10 min, 4C保存。,四、微生物鉴定-鉴定实例2,形态学鉴定,图 25C培养7 d菌种的宏观形态和显微形态Fig Macromorphology and micromorphology on 25C, 7 d注: A菌落形态;

21、 B: 分生孢子梗形态( 100); C: 分生孢子形态( 400).Note: A: Colony morphology, B: Conidiophore morphology ( 100); C: Conidial morphology ( 400).,该菌株的形态学特征符合黑曲霉A. niger的形态特征,四、微生物鉴定-鉴定实例2,Biolog鉴定,注: : 没有生长; +: 生长旺盛; w: 微弱(边界)生长; v: 可变.Note: : No growth; +: Strong growth; w: Weak growth; v: Varied growth.,四、微生物鉴定-鉴定

22、实例2,ITS rDNA区序列分析,图 CMCC(F)98003的ITS rDNA区序列和-微管蛋白基因序列PCR扩增结果Fig ITS rDNA and -tubulin gene PCR amplification results of CMCC(F)98003注: M: DL2000 marker; 1: ITS rDNA区PCR扩增结果; 2:-微管蛋白基因PCR扩增结果.Note: M: DL2000 marker;1: ITS rDNA PCR amplification result ; 2:-tubulin gene PCR amplification result.,注: 以

23、18S和ITS1区之间的TTACCG序列中的第一个“C”为1位点.Note: The first C in the border sequence (TTACCG) of 18S and ITS1 is here defined as position 1.,四、微生物鉴定-鉴定实例2,ITS rDNA区序列分析,以18S和ITS1区之间的TTACCG序列中的第一个“C”为1位点。,140,166,172、173,四、微生物鉴定-鉴定实例2,ITS rDNA区序列分析,图 基于ITS区rDNA序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树Fig A Neighbor Joining Tree of Aspe

24、rgillus section Nigri. based on Their ITS DNA Sequences注: 图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值, 图例为遗传距离.Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, genetic distance.,CMCC(F)98003与与A. niger ATCC 16888聚类在分类距离最近的一个分支上, 序列相似性达100% 。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性也具有很高的相

25、似性, 序列同源性均在98.6%100%之间。,四、微生物鉴定-鉴定实例2,-微管蛋白基因序列分析,图 基于-微管蛋白基因序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树Fig Neighbour-joining tree based on -tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri注: 图中发育树节点只显示Bootstrap 值大于50%数值, 图例为遗传距离.Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, ge

26、netic distance.,CMCC(F)98003与黑曲霉A. niger CBS554.65T序列同源性为100%。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性均在94.7%以下。,结合形态学、碳源利用情况和ITS rDNA序列系统发育分析等多相鉴定的结果, 将CMCC(F)98003鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger ）。,四、微生物鉴定-鉴定实例2,五、微生物保藏,菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、

27、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。 中国微生物菌种保藏管理条例,五、微生物保藏,制订专门菌种保藏管理制度；同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中； 对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理； 设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。,五、微生物保藏,微生物菌种保藏方法基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。,五、微生物保藏,常用菌种保藏方法,定期移植法液体石蜡法真空冷冻干燥法-80低温冻结法液氮超低温冻结

28、法,定期移植法,亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于46进行保存并间隔一定时间（3-6个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。操作步骤： 斜面制备 接种 培养 保藏,斜面制备,培养基配制,分 装,灭 菌,摆放斜面,接 种,培养细菌37 ，1-2d酵母 2830，23d丝状真菌26 ，57d,保藏46保藏36个月,培养和保藏,定期移植法操作简单，使用方便；对设备和人员要求不高；可随时使用，便于观察菌种；工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；菌种传代频繁，易退化、污染。,液体石蜡法,指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好后注入灭菌的液体石

29、蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（46）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。,操作步骤：,液体石蜡预处理,斜面培养物制备,灌 注 石 蜡,保 藏,优质化学纯液体石蜡灭菌： 121湿热灭菌30min，蒸发水分； 160 干热灭菌2h；冷却至室温。,液面高出斜面顶部1cm,46 ，干燥处；直立放置；保藏时间1 2年。,液体石蜡法操作简单，使用比较方便；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；菌种易退化、污染。,真空冷冻干燥法,指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。,安瓿管的准备清洗选用中性玻璃材质的安瓿管；2%盐酸浸

30、泡810h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗23次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160定型2h；标签激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约1020mm。喷码于安瓿管外，160固定20min。灭菌 121 ，30min.,保护剂的准备保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，25ml/管；灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113灭菌20min；打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；30培养2天，无菌检查合格后备用。,冻干样品制备制备斜面培养物；将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0

31、.10.2ml/管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。,真空干燥 在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.613.3Pa，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。终止干燥时间应根据下列情况判断：安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状真空度接近空载时的最高值样品温度与管外温度接近选用12支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结,预冻制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；分装完成后将安瓿管立刻放入3540冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；可采用分段式预冻，先将分装好的安

32、瓿管置20冻30分钟，再放入80冰箱冻30min；采用离心式冻干装置时勿需预冻。,熔封 将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；拉管时注意火焰不要离菌体太近。,真空度检测 用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝光，说明真空度符合要求。,保藏 46下避光保藏，一般可保藏810年。,真空冷冻干燥法保藏、运输方便；保藏时间长(5 10年)；对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操作水平要求高；冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。,-80冰箱冻结法,将菌种悬浮于保护剂中，在80冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。,准备冷冻管,准备保护剂

33、（ 10%-15%甘油）,准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）,制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）,保藏（ -80，25年）,Microbank,-80冰箱冻结法使用方便；保藏时间较长；对设备要求高(-80冰箱)；运输不方便。,液氮超低温冻结法,指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于196的液氮或150左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。,操作步骤冷冻管准备保护剂制备保藏培养物准备预冻 将程序降温系统预冷到4，将制备好的冷冻管放入其中，以1/min降温速率降至-35； 使用程序降温盒。保藏 将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150)或液相(-196)。,同“80冰箱冻结法”,液氮

34、超低温冻结法保藏时间长；保藏效果好，菌种不易退化；对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平要求高；保藏成本高。,不同保藏方法的比较,六、质控微生物,保藏菌株要求,药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。,92,2010版中国药典药品微生物实验室规范指导原则,国内认可的菌种收藏机构,1979年7月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种保藏管理委员会（CCCCM），委员会下设7个全国性菌种保藏管理中心及机构所在地：普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）, 中国科学院微生物研究所农业微生物菌种保藏管理中心

35、（ACCC）,中国农科院区划所工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工业研究院医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院,国认外可的菌种收藏机构,世界菌种保藏联合会WFCC (World Federation Of Culture Collection)全球注册的菌种保藏机构583家ATCCNRRLDSMZNCTCCMICBSNBRC(IFO)JCM,菌株代数,美国药典（USP）中规定

36、：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为一代，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”。 United States Pharmacopoeia (USP) provides that: to microbial inoculation to a fresh medium on / in each germination time is referred to as a generation, and provides that strains of the passages (from the original strain from freeze-drie

37、d powder) must not exceed 5 generation. “ 我国的GMP认证中也如此要求，并且中国药典2005年版药典也已做出“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”这个明确的规定。 Chinas GMP certification is asking, and the Chinese Pharmacopoeia 2005 edition of Pharmacopoeia also had a strain of the passages (from the original strain from freeze-dried powder) should n

38、ot exceed 5 on behalf of The clearly defined.,Enrichment (G1),Separation of single-olony(G2),Working strain (W3),Working strain (W4),Working strain (W5),标准菌株提供形式,Accuracy,Easy of Use(preparation),High,Low,Complicated,Easy,Quanti Cult (REMEL),Standard Strains (ATCC/NBRC etc.),EZ-CFU one step (MicroBioLogics),KWIK-STIK (MicroBioLogics),Culti Loops (REMEL),BioBall (BTF/bioMerieux),质控菌株,Primary strain,Qualitative strain,Quantitative strain,视频材料质控菌株的使用,质控菌株,