基因功能的研究方法.ppt

1、第十章.基因功能的研究方法（一）,一、计算机预测基因功能二、实验确认基因功能1基因失活是功能分析的主要手段1.1 基因敲除（Gene knock-out）1.2 基因敲除的技术路线1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨2转座子突变库的构建2.1 插入序列2.2 实验步骤,3内含子归巢突变4基因的超表达用于功能检测5. 反义RNA5.1 反义RNA的分类和作用机制5.2 ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA )5.3 反义RNA的功能5.3.1 调控细菌基因的表达5.3.2 噬菌体溶菌/

2、溶源状态的控制5.3.3 IS10转位作用的抑制5.4 人工合成构建反义RNA5.5 使反义RNA分子稳定的方法,三、其他的基因功能研究方法噬菌体展示(phage display)酵母双杂交 (yeast two-hybridization) 2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map）3. 开放读框顺序标签(open-re

3、ading-frame sequence tags,OSTs）,确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度很大的领域。一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们所了解的基因组内容比真实的情况少的多。如大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前已经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突变鉴定，但实际上还有很多空白。大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知道的只有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母，所知更少，仅为30%。,一、计算机预测基因功能,计算机预测基因功能的依据仍然是同源性比较。同源基因都有1个共同的祖先基因，他

4、们之间有许多相似的顺序。同源基因可以分为2类：,种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之前的同一祖先。种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因为这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但它们有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸位置是相同的。当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的相关性可从已知的同源基因

5、推测新基因的功能。,根据同源性预测基因时必需注意以下几点：,一般认为aa的一致性或相似性在25%以上可视为同源基因；同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的80%的相似性不能称为同源性。一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序列中所占的比例，而相似性除一致性aa外还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的比例总是高于一致性aa。,同源性分析可以给出整个基因或某一区段功能的信息,同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多种，而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要比核苷酸的差异大的多。以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更加可行。已有许多软

6、件可用于这项分析，常用的是BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子邮件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会得到回音。,有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出现局部相似的区段。这种情况表明，2个无亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相似的顺序是功能的核心区域。虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却有共同的起源。它们都是古老祖先的后裔，在进化中一方面发生独立突变，另一方面又因基因组重排成为新基因的组成部分。例如信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基本的功能域，即接受信号的功能域和传达信号的激酶域。,二、实验确认基因功能,同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能分析还必需依赖其他的实验

7、手段进行补充，并将同源性研究的结果进一步外延。如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难的问题之一。大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究是远远不够的。基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系列反应。传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因；现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型。因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基因相关的表型。,1基因失活是功能分析的主要手段传统的遗传分析主要借助突变型研究表型变异的遗传基础，利用紫外线诱导及化学试剂处理可使生物群体产生突变个体，也可从自然的群体中发现突变体。经遗传分析将突变基因定位，然后观察这一突变体

8、是否与改变的表型对应。在此基础上采用分子生物学方法进一步分离与克隆目标基因。,所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的分子标记，然后通过物理图寻找靶位点。上述传统遗传学分析的原理同样可用来设计从基因到表型的研究。如果我们能找到某种方法，根据待测基因的顺序使生物体内该基因失活，亦可鉴别由此产生的表型变异。,1.1 基因敲除（Gene knock-out）概念：基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。,基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。80年代初，胚胎干细胞

9、（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。,1.2 基因敲除的技术路线如下：构建重组基因载体；用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内；用选择培养基筛选已击中的细胞；将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。,Note:基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内外源DNA与靶

10、细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低，约为百万分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作。因此，同源重组的筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题。目前已有多种筛选方法，其中1988年犹它大学的Capecchi教授的研究组发展的正负双向选择系统适用范围宽且效率较高。,1.3 基因敲除主要应用领域及国内外研究进展基因敲除的应用领域主要有：建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料；改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能；治疗遗传病；改造生物、培育新的生物品种。,ES细胞基因敲除途径建立转基因小鼠技术的成熟，首次使体外精细的基因操作与小鼠的整个生长发育和生命过程

11、得到了直接的结合，为探讨高等动物基因组结构和功能提供了有效的方法。由基因敲除技术产生出的特殊小鼠已经对哺乳类生物学的各领域，包括发育生物学、癌生物学、免疫学、神经生物学和人类遗传学产生了极大影响。理论上，基因敲除可适用于任何能产生ES细胞的物种，将来可在小鼠基因敲除成熟的基础上开展其它实验动物的基因敲除工作。,建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料 基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分子基础及诊断治疗的重要实验材料。如1989年囊性纤维化病（CF）的致病基因（CFTR）被成功地克隆；1992年成功建立了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型，为CF基因治疗提供了很好的动物模型，得以顺利

12、通过了基因治疗的动物试验；于1993年开始临床试验并获得成功。,改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现，可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用，为研究基因的功能和生物效应提供模式。例如，目前人类基因组研究多由新基因序列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在小鼠上观察该基因缺失引起的表型变化。目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、LTD 有缺陷的基因敲除动物，发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不可少。,治疗遗传病 这包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗的目的。改造生物、培育新的生物品种 细菌的基因工程技术是本世纪分子

13、生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着广阔的应用前景。,1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨通过上述种种方法得到的携带失活基因的品系与个体后，下一步工作就是检测突变体表型以便指认未知基因的具体功能。这一步也会遇到难题，生物表型范畴很广。即使单细胞的酵母，要确认一个未知基因对表型的贡献，也可列出很长的一串名单。至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综合性，区分其准确的功能更加棘手。,2转座子突变库构建 转座子标签法又称基因标签(gene tagging)，通过构建插入突变库系统，分离与克隆功能基因与调控顺序。这一

14、策略主要依据以下技术：植物体细胞全能性；已经建立了一套成熟的转基因系统，使外源基因在转基因植株中成功表达。,植物中有许多转座子系统，它们的转座机制已经清楚，通过转座子的随机插入可获得大量的突变型，根据插入的转座子序列合成探针，可分离被破坏的位点，并分析它们的组成。转座子可以发生回复突变，从插入的座位脱离，使突变系重现野生型表型。,目前应用的最成功的是玉米的Ac-Ds转座因子系统。基因标签突变库的工作原理如下：玉米色粒调控元件Ac-Ds 系统：第9 染色体 C 基因：色素合成基因。 Ac 基因：自主移动的调节因子，4.5 kb， 5 个exon， 编码转座酶。 Ds 基因：非自主移动的受体因子，

15、 0.54.0 kb，与Ac 有同源序列 ，插入引起色素不能合成。,2.1 插入序列(insertion sequence, IS) 仅含有转座酶基因的简单转移序列。长度多在7001500bp左右。 由末端反向重复序列(IR)，转座酶基因组成。插入基因组中时，在靶位上生成正向重复序列(DR)常见的IS结构 。IS 长度 末端IR 靶位DR 插入选择IS1 768 23 9 随机IS2 1327 41 95 热点IS4 1428 18 （12） AAAN20TTTIS5 1195 16 4 热点IS10 1329 22 9 TNAGCN IS50 1531 9 9 热点,2.2 实验步骤将Ac因

16、子转座酶的编码基因与组成型启动子如35S构建成嵌合基因表达载体，由于除去了转座因子两侧的反向重复顺序，转座酶的编码基因不能自我转座。这一表达载体转化细胞获得的再生植株为（sAc）。外显子捕获载体构建：在转座子的边界顺序与标记基因之间插入内含子剪接受体顺序，将它们转化细胞获得再生植株B。,将植株和植株B杂交，在转座酶的作用下来自植株B的转座子可以切离与转座。当它们插入到某一外显子中时，基因转录加工后可能获得含正确读框的mRNA。根据突变表型与标记基因的共分离筛选转化无性系，通过自交可得到纯合的不含转座酶基因的插入突变系。增强子捕获载体将核心启动子TATA盒框与标记基因编码顺序连接，然后在其两侧安

17、装转座子边界，转化细胞获得再生植株C。将植株A与植株C杂交，在转座酶的作用下来自植株C的转座子可以转移到增强子下游启动标记基因表达。采取类似4的方法分离纯合的插入突变系，进一步检测增强子的组织特异性表达场所。,上述方法用于拟南芥的基因打靶(gene targeting)取得了很好的效果，并已应用于水稻，玉米等作物的功能基因分离。但它们也有2点不利之处：插入突变往往是隐性的，必须建立自交的 F2代群体才能找到突变株系；植物基因组有大量的冗沉基因，它们可取代突变基因的功能，很多突变的效果不易鉴定。改进方法为采用功能增益突变路线，即在转座子边界内部加入强启动子。,3内含子归巢突变什么是内含子归巢?

18、在I类II类的某些内含子中含有开放读框，可产生具有三种功能的蛋白。 这些蛋白可使内含子（或以其原来的DNA形式，或作为RNA的DNA拷贝）移动(mobile)，使内含子可插到一个新的靶位点，这个现象叫做归巢（homing）。I组和II组内含子分布很广，在真核和原核细胞中都有发现。,在这些内含子的开放读框中编码具有三种功能的蛋白，这些蛋白与DNA或RNA的代谢有关。核酸内切酶：在DNA的靶位点剪切，使内含子得以插入；反转录酶：涉及将内含子RNA变成DNA拷贝；成熟酶：从前体的RNA中切掉内含子的部分。,第I组内含子具有编码核酸内切酶的开放读框；有时成熟酶的活性和此蛋白有关。第II类内含子具有编码

19、核酸内切酶和反转录酶的序列，另外成熟酶的活性也与此蛋白有关。在有些情况下还具有与其它酶活性相关联的成熟酶功能的遗传信息，成熟酶主要功能是使内含子的构象稳定，这于剪接来说是很必要的。,现已知道有些第I组内含子编码核酸内切酶，它们的作用是帮助内含子在杂交中能插入到其不同等位基因的座位中。在真菌的线粒体中普遍存在着内含子的多态性或者缺乏内含子，有种观点认为内含子来源于基因的插入。通过分析酵母线粒体的大的rRNA基因在杂交中的重组，另一种观点认为以上的现象是基因的丢失。,在第I组内含子中含有编码序列。这些内含子存在于“+”的酵母品系中，但另一品系“-”中缺乏此内含子，将+和-进行杂交其后代通常都是+。

20、如果我们将+品系看作供体，将-品系前成受体，我们从+-杂交中会发现-基因组中产生了内含子的新拷贝，结果使全部后代都表现为+。在两个亲本任何一个都可发生突变而抑制以上的归巢。,突变的结果使杂交后代中出现了正常分离，即+和-的后代中出现了正常分离，即+和-的后代数相等。这种突变表明了这个过程的性质。在+的品系中突变发生在紧靠着内含子将要插入的位点。在-品系中突变发生在内含子的开放读框中，从而阻止了蛋白质的合成。这表明在+品系中的内含子编码的蛋白识别-品系的靶位点，将其切开，并将内含子的一个新拷贝插入切开的靶位点中，使之变成+品系，而且能稳定地遗传。,这种蛋白的作用是什么呢？内含子的产物是一种核酸内

21、切酶，它能识别-基因并将它作为靶点切开其双链。这种核酸内切酶识别18bp的靶序列，此含有内含子插入位点。靶序列的剪切是在每条链插入位点的3端这一侧2个碱基处交错切，这样剪切位点占4个bp，产生了凸出的单链末端。这种类型的剪切是和转座子移到新位点的机制有关。双链的断裂起始了基因的转变，在转变中+基因序列产生了一个新拷贝取代-基因，这个过程涉及通过复制机制进行转座，且仅在DNA水平上发生或以DNA取代的方式，或以模板转换的方式（与重组修复相类似）来完成。要注意内含子的插入中断了内切酶对这个序列的识别，这样使其稳定。,其它含有开放读框的第I类内含子也可以移动。内含子永久存在的机制是相同的：内含子编码

22、的核酸内切酶剪切内含子将之插入特殊的靶位点。插入的细节是有不同的。例如T4噬菌体td内含子所编码的核酸内切酶就是在靶位点上游24bp处剪切，然后内含子本身插入这个位点，而不是其新产生的拷贝。,虽然内含子移动的机制是共同的，但靶位点的序列和内含子编码区域之间并无同源性。据推测内含子有一个共同的进化区域，但很明显它们有很大的歧化。靶位点是在各种靶序列中最长的，对于核酸内切酶来说也是最特异的。结果内含子永久性地插入到单个的靶位点中，而且不插入基因组的任何其他地方，此就称为内含子归巢( intron homing)。含有编码核酸内切酶序列的内含子在不同细菌和低等真核生物中都有所发现。由此产生一种游离的

23、因子，其编码的功能涉及到RNA的剪接或者DNA分子之间的移动。与此相关的观点认为内含子编码区域中密码子的用法与外显子稍有不同。,在第类内含子中大部分开放读框都具有一个与反转录转座子相关的区域（除核酸内切酶编码区之外）。这种类型的内含子在低等真核生物和某些细菌中都有发现。反转录酶对于内含子来说是特异的，而且和归巢有关。反转录酶以初始mRNA为模板合成内含子的DNA拷贝，通过采用与反转录病毒相似的机制使内含子插入到靶位点中。和这种情况有关的此种类型的反转录转座子与失去LTRs的一组反转录子是相似的。在靶位点产生缺口，形成的3-OH对于引发来说是需要的。,第类内含子归巢的例子与前面介绍的反转录转座子

24、转座的机制相似，内切酶在靶位点的双链DNA上切一切口，在缺口上产生了3末端为反转录酶提供了引物。内含子RNA为cDNA的合成提供了模板。由于此RNA含有内含子两侧的外显子的序列，所以此cDNA要比内含子本身长，它能跨越双链切口，结果是使内含子插入到靶位点。,将一种核糖核蛋白和DNA底物的一道温育在体内可产生移动系统。这个核糖核蛋白含有一个带有第II组内含子的RNA和它的蛋白产物。它具有核酸内切酶活性，在恰当的靶位点交错切割双链。核糖核蛋白的RNA和蛋白两种成份对于剪切都是需要的。在催化中二者可能都有作用。,可移动的内含子似乎是被插入到先前存在的基因中。它们可能进化为核内前体-mRNA内含子。具

25、有自我剪切的能力的内含子显示了剪接进化的重要作用。例如它们能移动到核中并成为snRNA的祖先。,内含子归巢突变就是利用归巢特性，将它们插到大肠杆菌的质粒载体中，另外再将人类HIV病毒和CCR5基因靶位DNA构建到另一载体中。当这2类载体在大肠杆菌或人类体外培养细胞中相遇，内含子RNA可以逆剪切方式插入到HIV和CCR5 DNA靶位中，而且表现为某种随机性。当内含子反向插入基因内部时，由于不表达IEP，成为永久整合。当内含子插入方向与IEP转录方向一致时，内含子可以继续转移破坏其他位点。这一系统可望用于缺少同源重组系统生物的功能基因组研究。,4基因的超表达用于功能检测,基因功能的检测除了使其失活

26、外还可让其过量表达，基因产物的不足与过量都会破坏这种平衡，表现生长与发育的异常。基因的超表达有两种技术： 1. 增加基因的拷贝数； 2. 采用强启动子促使基因表达,5. 反义RNA反义RNA(anti sense RNA)是指mRNA互补的RNA分子。这种反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合，从而抑制该mRNA的加工与翻译，是原核细胞中基因表达的调控的一种方式。然而，许多实验证明，在真核细胞中亦存在反义RNA，但其功能尚未全部明了。最近几年来通过人工合成反义RNA的基因，并将之导入细胞内，转录出反义RNA，即能抑制特定基因的表达，阻断该基因的功能，有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。

27、同时也暗示了该方法对肿瘤实施基因治疗的可能性。,5.1 反义RNA的分类和作用机制 下表总结了原核细胞内天然存在的11种反义RNA。这些反义RNA按其作用机制可经分为三大类。类：这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区，引起翻译的直接抑制(A类)或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶的敏感性增加，使其降解(B类)。,类：这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚，可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。类：这类反义RNA可直接抑制

28、靶mRNA的转录。,5.2 ticRNA transcription inhibitory complementary RNA ticRNA是大肠杆菌中CAP蛋白(cAMP结合蛋白)的mRNA的反义RNA。ticRNA的基因的启动子可被cAMP-CAP复合物所激活，从CAP mRNA的转录起始位点上游3个核苷酸处开始，以CAP mRNA的模板DNA链的互补链为模板，合成ticRNA。,ticRNA具体长度不清楚，但是它是5端一段正好和CAP mRNA的5端有不完全的互补，可以形成双链的RNA杂交体。而在CAP mRNA上紧随杂交区之后的是一段约长11bp的A，U丰富区。这样的结构十分类似于不依

29、赖性的转录终止子的结构，从而CAP mRNA的转录刚刚开始不久后即迅速终止。从这个例子中我们可以看到CAP蛋白合成的自我调节作用。当CAP合成达一定量后，即可与cAMP结合成cAMP-CAP复合物。再激活ticRNA的启动子转录出ticRNA，反过来抑制CAP-mRNA的合成。,5.3 反义RNA的功能在原核生物中反义RNA具有多种功能，例如调控质粒的复制及其接合转移，抑制某些转位因子的转位，对某些噬菌体溶菌-溶源状态的控制等。 下文仅举数例：,5.3.1 调控细菌基因的表达反义RNA对编码CAP基因的调控作用已如前述。这里再介绍一下micF RNA对ompF基因的表达的调控。ompF蛋白质是

30、大肠杆菌的外膜蛋白的主要成分这一。micF RNA是从另一基因(ompC基因)附近的DNA序列转录而来，和ompF mRNA的5端有70%的序列互补，因此在体外micF RNA可以抑制ompF mRNA的翻译。但是这种抑制作用在体内是否重要尚有疑问，因为缺失micF基因的菌株其ompF蛋白的表达只受到轻微的影响。,5.3.2 噬菌体溶菌/溶源状态的控制反义RNA也参与了和P22噬菌体的溶菌/溶源状态的控制。P22噬菌体编码一种抗阻遏蛋白Ant，它可以抑制许多样噬菌体的阻遏蛋白与DNA的结合。这对于刚刚感染细胞的P22建立样原噬菌体(prophage)是有益的。但是Ant必须在严格的控制下，否则

31、Ant的过分表达必将阻止溶源状态的建立，而成为溶菌性的噬菌体。Ant蛋白质表达的控制是利用反义RNA(sarRNA)能与ant mRNA的翻译起源区互补结合，从而抑制ant mRNA翻译成Ant蛋白。,在噬菌体中c蛋白控制着溶菌或溶源状态的选择。c蛋白可以激活Pre启动子，该启动子控制的基因是噬菌体整合作用所必须的，且同时能抑制噬菌体的复制。c蛋白的另一功能是延缓晚期基因的表达，其作用机制是c蛋白激活PaQ的启动子，转录出PaQRNA。PaQRA是编码Q蛋白的mRNA的反义RNA。因此，PaQRNA能与QmRNA配对杂交而抑制其翻译，而Q蛋白早已知道是晚期基因表达的激活蛋白。c基因本身的表达还

32、受到称为oopRNA的反义RNA的调控。oopRNA与c基因的3端互补，但其具体作用机制尚不清楚。,5.3.3 IS10转位作用的抑制outRNA是一种反义RNA，可以和IS10编码的转位酶mRNA(INRNA)5端结合而抑制其翻译，当细胞内只有一个拷贝IS10时，只能生成很少量的outRNA，故转位酶仍可生成。但当IS10的拷贝数增多时，outRNA愈来愈多，其控制作用亦明显增强，所以称为多拷贝抑制现象。这种现象可以防止IS10的过量堆积引起的细胞损害。,5.4 人工合成构建反义RNA 既然反义RNA在原核生物中对基因表达起着重要的调控作用，那末人工设计在天然状态下不存在的反义RNA来调节靶

33、基因的表达，想必也是可能的。这已在不少实验中得到证实。由于目前对靶mRNA的SD序列的上游区的结构了解甚少，因此，在要设计类反义RNA用于和靶mRNA SD序列上游区结合，以期达到调节该mRNA翻译的目的是比较困难的。,类反义RNA是和mRNA的起始处结合而形成类似-不依赖性的转录终止子而使转录水平上抑制靶基因的表达。因此，要设法在靶mRNA上找到一段连续的U序列，就可以设计出反义RNA，与该U序列上游的mRNA链互补，以形成-不依赖性终止子。理想的作用位点是在靶mRNA的5端上游的非编码区，以免受核糖体的影响。只要靶基因的核苷酸顺序已经知道，就可以人工设计出类反义RNA。有时还可设计同时具有

34、类和类反义RNA功能的反义RNA。,我们还可以设计出天然存在的反义RNA的反义RNA来。这样就可以拮抗原始反义RNA对靶mRNA的抑制作用。而达到激活或加强某个靶基因的表达的目的。然而并不是所有的mRNA对其相应的类反义RNA都敏感。例如：有的mRNA寿命很短，只有1-2分钟，它们和反义RNA结合的机会较少，因而就较不敏感。反之，另一些mRNA则很稳定，寿命可达十多分种，则其对相应的反义RNA的抑制作用就很敏感。此外，反义RNA本身的稳定性有很大的实际意义。显然，稳定的反义RNA对靶mRNA的调节作用比不稳定的反义RNA要好。,5.5 使反义RNA分子稳定的方法反义RNA 3端带有茎环结构或类

35、似-不依赖性终止子结构时，可以稳定RNA分子。,Gorski等还发现在T4噬菌体的基因32 mRNA的5端上游的茎环结构及其附近的序列亦可稳定RNA分子。所以在设计反义RNA基因时，最好将产生3及5端这种二级结构的序列克隆在反义RNA基因的两端。Hirashima等1986年发现，针对靶mRNA的SD序列和AUG区域的反义RNA，要比单纯对编码区域的反义RNA更为有效。1989年Hirashima又发现，针对SD序列和它的上游区域（但不包括AUG）的反义RNA更为有效。在真核生物中，针对5端非编码区的反义RNA更有效。但也有实验表明针对第一内含子的反义RNA也同样有效。,现在设计反义RNA基因

36、是时应注意几点总结如下：长的反义RNA并不一定比短的反义RNA更为有效。在原核生物中针对SD序列及其附近区域的反义RNA可能更有效。在真核生物中，对应于5端非编码区的反义RNA可能比针对编码区的反义RNA更有效。,尽量避免在反义RNA分子中出现自我互补的二级结构。设计的反义RNA分子中不应有AUG或开放读框，否则该反义RNA亦会与核糖体结合而影响其与靶mRNA的配对结合。进一步还可以将带有ribozyme结构的RNA连在反义RNA的3端尾上，当反义RNA与靶mRNA杂交后，即可利用其酶活性来降解靶mRNA。,此外，为了增强反义RNA的作用，还可以采取一些额外措施，例如：由于反义RNA对靶mRN

37、A的抑制作用有剂量依赖性，所以在构建反义RNA基因时，要选择强的、可以诱导的启动子以增强反义RNA本身的表达。构建许多个反义RNA基因串连在一起，以得到线性重复的多拷贝基因，对提高反义RNA的表达也有利。RNA酶可以降解RNA：RNA杂交体，所以在构建反义RNA基因时，可将RNA酶的基因也同时转化到靶细胞中并进行表达。这样，当反义RNA与靶mRNA结合后，RNA酶即可将其降解。这显然有利于反义RNA的抑制作用。,三、其他的基因功能研究方法,基因失活与过量表达是研究基因功能的基本方法，但还有一些其他的方法可将基因失活及过量表达所知的结果进一步延伸与深化，对蛋白质活性进行综合研究。,噬菌体展示(p

38、hage display)噬菌体展示是一项筛选技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。,最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个

39、可结合克隆进行定性。,展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面，包括绘制抗原表位图谱、研究蛋白质-蛋白质相互作用和鉴定非肽配体的肽模拟物。生物活性肽分子的鉴定既可通过对固定的纯化受体进行淘选，也可在完整细胞上进行淘选。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和标签，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体。另外，大的蛋白质分子，如抗体、激素、蛋白酶抑制剂、酶和DNA结合蛋白也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的突变体。,PhD-C7C噬菌体展示肽库试剂盒是将随机七肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上而构建成的一个组合文库。与其

40、他NEB展示肽库不同的是，所展示的随机多肽两侧各有一个半胱氨酸。在非还原条件下，这两个半胱氨酸自发地形成一个二硫键，使展示的多肽环化，而PhD-7和PhD-12肽库则展示线性多肽。受限于二硫键环内的7肽库已被证实能识别抗原表位结构，D-氨基酸靶分子的镜像配基及开发以多肽为基础的治疗药物。,二硫键环内的7肽表达在pIII的N末端，第一个半胱氨酸紧接于丙氨酸后，第二个半胱氨酸后有一小段间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，然后是野生型pIII蛋白。该文库含有1.2109个电转化序列（可能的随机七肽序列数为：207=1.28109），用10 l本试剂盒提供的噬菌体进行扩增，每个序列一次可产

41、生约200个拷贝。原始文库的大量测序结果表明该文库序列具有广泛的多样性，无明显的残基位置偏嗜。建议不要扩增原始文库来进行其他的淘选试验，因为一旦再扩增便可能会出现序列偏性现象。,酵母双杂交 (yeast two-hybridization) 2.1 概念酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。,酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控

42、转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的(modular)，往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域(domain)构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域(activation domain，DNA-AD)。,这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence

43、, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。,2.2 实验步骤根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-Library表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HI

44、S、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。,当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因His、Ade、LacZ、Mel1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-Library载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。,2.3 利用酵母

45、双杂交发现新的蛋白质和蛋白质 的新功能酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-Library载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在Genebank中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。,例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交Clontech Matchmarker System

46、3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。,2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 利用酶联

47、免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。,例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-Library载体上，将BD-Bait载体和每种AD-Library载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌

48、落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。,2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。,对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。 例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。,