现代分子生物学技术.ppt

1、第七章 现代分子生物学技术,（3）,第一节 聚合酶链式反应第二节 物理图谱的构建第三节 基因组测序技术第四节 分子标记技术第五节 基因表达研究技术第六节 DNA-蛋白质相互作用 研究技术,第三节 分子标记技术,一、遗传图谱(genetic map),遗传图谱(genetic map)又称遗传连锁图谱或连锁图谱(linkage map)。经典遗传 学时代的遗传连锁图谱主要是以家系分析或不同性状个体间杂交为基础，根据同源染色体上 等位基因的变化，通过计算重组率，确定染色体上基因座位的顺序和距离，构建基因的连锁图谱。,经典遗传图谱,人们把单倍体配子所有染色体上的全部基因称为一个基 因组。基因组内每条

2、染色体上的连锁基因称为一个连锁群。绘制遗传图谱就是要进行每条染 色体上基因座位的顺序和距离的确定，即主要通过家系分析，对不同性状之间、性状与标 记之间、标记与标记之间的连锁遗传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图。人类遗传图谱包括女性一种配子的23条染色体(记作23，X)和男性两种配子的23条染色体(23 ，X)、(23，Y)上的所有基因位点。,现代遗传图谱,70年代发展起来的DNA重组技术、DNA克隆技术和DNA探针技术无疑为拓展遗传图谱的构建途径创造了技术条件，也使人类基因定位的方法从细胞及染色体水平过渡到分子水平。DNA水平的多态性标记位点作为绘制现代遗传图谱的主要界标，大大提高图谱的 精确

3、度、准确性。遗传图谱的绘制也因此进入了一个崭新的时代。 现代遗传图谱的概念是由Botstein D等(1980)首先提出的，在此基础上，限制性片段长 度多态性RFLP作为遗传图谱的第一代崭新标记得以问世 。遗传图谱的第二代标记位点是大量的可变数量串联重复（VNTR)，包括微、小卫星(MS)或短串联重复(STR 或SSLP)。第三代标记是位点极其丰富的单核苷 酸多态性(SNP)。,二、分子标记的概念,广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点

4、的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳： 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。,三、分子标记的种类,分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括：限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）； DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）；原位杂交（in situ hybridization）等；,第二类是以聚合酶链式反应（Polyme

5、rase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包括： 随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）； 简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）； 扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）； 序标位（Sequence tagged sites, 简称S

6、TS标记）； 序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；,第三类是一些新型的分子标记，如： 单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）； 表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。,四、分子标记的特点,（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（

7、4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。,五、几种常用的分子标记,（一）限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 该技术由Grodzicker等于1974年创立。 特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化

8、）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。,EcoR酶切示意图,5 AG-GAATTC-GAATTC-GAATTC-CG 33 TC-CTTAAG-CTTAAG-CTTAAG-GC 5 AG-G AATTC-G AATTC-G AATTC-CG TC-CTTAA G-CTTAA G-CTTAA G-GC5 AG-GAATTC-GAATCC-GAATTC-CG 33 TC-CTTAAG-CTTAGG-CTTAAG-GC 5 AG-G AATTC-GAATCC-G AATTC-CG TC-CTTAA G-CTTAGG-CTTAA G-CG,基本步骤： DNA提取用DNA限制性内切酶消化

9、凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上 用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交） 放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。,RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。,A,B,A,B,限制性内切酶位点,与放射性探针结合部位,限制性内切酶酶切后；电泳分离DNA片段；转移至硝酸纤维素薄膜；与放

10、射性探针杂交，分析阳性条带,（二）染色体原位杂交,染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子标记技术。目前发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。,荧光标记原位杂交原理示意图,原位杂交技术的基本步骤为,制备探针；染色体制片；染色体处理与变性；染色体与探针杂交；显微检测。,染色体专一位点探针,荧光标记探针检测精子,（三） 随机扩增多态性DNA

11、标记(RAPD),由Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致。 RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。,亲本中国春小麦、节节麦双倍体和子代的RAPD电泳图谱,引物为S516: CTCTGCGCGT 泳道1为中国春小麦，泳道2、二者的子代，泳道3为节节麦。,RAPD扩增克隆鱼(B)

12、、供体红鲤(A)、受体金鱼(D)和杂交鱼(C，即AxD)的细胞核DNA指纹图谱。结果显示，对于不同的引物，克隆鱼的扩增谱带均和供体红鲤的一致，迥异于受体金鱼和杂交鱼。,RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。,（四）简单序列重复标记，SSR,又称微卫星DNA(Micro-satellite DNA)标记；属高度重复序列，重复单元26bp，如(CA)n、(AT)、(G

13、GC)n等重复，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。,TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG,微卫星DNA PCR扩增结果（示例）：,500bp400bp300bp240bp,该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。,SSR标记的主要特点,（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）

14、由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。,（五）单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism SNP),1. 定义单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 不同个体间，基因组DNA某部位的 单核苷酸的变异。1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记（single nucleotid polymorphism SNP）制备第三代遗传连锁图的遗传标记。,2. SNP在人类基因组中出现的频率,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总

15、数可达1700万个甚至更多。 There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to three million SNPs. 在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding sNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。,3. SNP检测方法,目前已有多种方

16、法可用于SNP检测：根据DNA列阵的微测序法；动态等位基因特异的杂交；寡聚核苷酸特异的连接； DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。,4. SNP用作遗传标记的优点,(1) SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。(2)它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。(3)与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。(4)部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗

17、传机制的候选改变位点。(5)易于进行自动化分析，缩短了研究时间。,5. SNP的意义,对于人类来说，SNP的意义在于：、致病SNP、疾病易感性SNP、具有诊断价值的SNP、疾病的SNP谱、人表型相关SNP、药物作用与不良反应的SNP、药物剂量SNP,日本学者发现糖尿病基因的个人SNP差别,日本研究人员最近经过研究发现，与糖尿病有关的基因并不是千篇一律，它们之间存在着个人差别，即“单核苷酸多态性”（SNP）。,预计今后SNP将在下列领域发挥重要作用：(1)进行简单和复杂疾病的遗传连锁分析(linkage analysis)及关联分析(association analysis),用于疾病易感基因定

18、位；而且其定位的精度将比微卫星标记精细得多，可直接用于指导易感基因克隆。(2)在“药物基因组学”(pharmacogenomics)研究中，可通过检测SNP的遗传多态性标记揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异的根本原因。(3)也可用于法医研究的罪犯身份的鉴别、亲子鉴定等，此外在器官移植中供体和受体间的配对选择及物种进化的研究中都将具有重要意义。,分子标记技术在植物研究中的应用,分子遗传图谱的构建遗传多样性与种质鉴定重要农艺性状相关基因的定位分子标记辅助选择 重要农艺性状的图位克隆,浏览以下网站国内： 天大生物信息中心http:/ 北大生物信息中心 http:/ 中国生物信息http:/ww

19、w.biosino.org/国外 美国国家生物技术信息中心(NCBI) http:/ncbi.nlm.nih.gov 欧洲生物信息学研究所(EBI) http:/www.ebi.ac.uk,http:/ affecting drug effects,Polymorphisms in enzymes that metabolize drugs are responsible for unexpected toxicity after administration of a normal drug dose.SNPs in the coding regions of genes of the en

20、zymes necessary for the biotransformation of endogenous and exogenous compounds can decrease or even prevent drug metabolism.,Cytochrome P450,细胞色素450 (CYP)同功酶是药物代谢酶并显示了基因多态性。人体内有六种不同的细胞色素450 ：CYP1A2 , CYP2C9, CYP2C1 9, CYP2D6, CYP2E1和CYP3A4负责清理体内药物。 CYP2C9, CYP2C1 9, CYP2D6的多态性与个体间差异有很大关联性。如果有人缺失这种酶 ,常常被称为差的或慢的药物代谢体(poor metabolizer), 这种人有较大的高药物浓度中毒的可能性 ;如果有高活性或过量的这些酶 ,就被称为快速的代谢体 ,这种人对药物治疗可能有抗性。,