华南师范大学实验报告.doc

1、- 1 -华 南 师 范 大 学 实 验 报 告学生姓名 林 鸿 锦 学 号 20070004002 专 业 综合理科二班 年级、班级 07 级 课程名称 生物化学 实验项目 醋酸薄膜电泳分离血清蛋白实验类型 验证 设计 综合 试验时间 2008 年 9 月 8 日实验指导老师 陈 文 利 实验评分 一、目的1、掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作2、学会用醋酸纤维薄膜电泳分离血清中各种蛋白质组分二、原理在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，在电场中将向着与其所带电荷电性相反的电极泳动这种现象称为电泳。醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸

2、纤维素制成，它具有均一泡沫样的结构，厚度仅 120 微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白质电泳有简便、快速，样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白质，脂蛋白，血红蛋白，糖蛋白和同功酶的分离及用于免疫电泳中。蛋白质是两性电解质，在 pH 小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在 pH 大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。本实验把血清放在 pH8.6 缓冲溶液湿透的醋酸纤维膜上进行电泳，血清蛋白在 pH 环境中以不同速度向正极移动。结果，血清蛋白在膜条上分为前后几条平行带，从负极端起，依次为

3、 球蛋白、 球蛋白、2 球蛋白、 1 球蛋白和清蛋白。 三、材料、试剂与器具（一）材料1、新鲜血清一无溶血现象（稀释 5 倍）。2、醋酸纤维素薄膜28 厘米(浙江黄岩曙光化工厂产品) 。（二）试剂1、巴比妥一巴比妥钠缓冲液（0.07M，pH8.6）：称取巴比妥 1.66 克和巴比妥钠 12.76克，溶于少量蒸馏水后定溶到 1000 毫升。2、染色液：称取氨基黑 10B 0.5 克，加入蒸馏水 40 毫升，甲醇 50 毫升和冰醋酸 10毫升，混匀，放于具塞的试剂瓶保存（可重复使用）。3、漂洗液：取 95%乙醇 45 毫升，冰醋 5 毫升和蒸馏水 50 毫升，混匀，在具塞的试剂内保存。（三）器具1

4、、培养皿（直径 910 厘米）- 2 -2、直尺、铅笔、竹镊、2/3 的盖玻片3、电泳仪和电泳槽4、普通滤纸5、染色缸四、操作步骤（一）仪器和薄膜的准备1、醋酸纤维薄膜的选择：实验中应选择质地均匀的薄膜，因为薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如薄膜不均匀可以造成区带歪扭不齐，各区带界线不清，背景脱色困难，实验结果难于重复等现象。选用薄膜时，若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一致的条纹或斑点等，为不均匀的薄膜。将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后用镊子夹住薄膜的边角,小心取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液

5、，同时分辩出光泽面和无光泽面，并在角上用铅笔标上记号。(注意:不要用手直接接触薄膜,带手套)2、制作“滤纸桥”（实验室已准备）（二）点样在薄膜无光泽的一面点样，点样区距负极端 1.5 厘米处。点样时，用 2/3 宽的盖坡片的轻轻的沾一层血清印在点样区，使形成具有一定宽度，粗细匀称的直线。图 1 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置（三）电泳将已点样的薄膜使光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，膜条上点样的一端靠近负极，盖严电泳室。平衡 10 分钟，以薄膜湿润为准。然后通电，调节电压至 130 伏，10分钟后和再调至 150 伏，电流强度为 0.40.6 毫安/厘米宽。在电泳过程中，应注意控制电压和电

6、流强度，防止过高或偏低，待电泳带展开约 3.5 厘米时关闭电源，通电时间为 45 分钟。图 2 醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图- 3 -（四）染色电泳完毕取出膜条，直接浸入染色液中，染色 510 分钟。然后用漂洗液浸洗，每隔10 分钟换一次漂洗液，直至蛋白区带底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。以下为实验得到的血清蛋白电泳图谱：图 3 醋酸纤维薄膜血清蛋白电泳图谱从左至右，依次为：血清清蛋白、1 球蛋白、2 球蛋白， 球蛋白、 球蛋白。五、结果讨论1、实验效果较好，是因为在点样、电泳、染色等环节基本能按照实验要求进行，应继续保持！2、由下表 球蛋白 球蛋白 2 球蛋白 1 球蛋白 血清清蛋白分

7、子量（D） 15 万 915 万 30 万 25 万 7 万等电点（PI） 6.857.30 5.12 5.56 5.65 4.64百分比（%） 20.3 11.53 7.15 3.75 56.7结合实验结果，可作出如下分析：（1）由五种蛋白在薄膜上的位置及它们的 PI 值可知，PI 值越小，离负极越远。这是因为，它们在同一缓冲液中，PI 越小的蛋白分子，会带上更多的负电荷，受阳极正电荷吸引力越大，所以跑得越远。（2）它们所占百分比的大小决定了区带的面积大小和颜色深浅。血清清蛋白所占百分比最大，所以它的区带面积最大且颜色最深， 球蛋白次之，其它也是同样的道理。3、针对实验过程中自己及其他同学出

8、现的这样那样的问题，通过自己研究或查找资料的方式，得到以下解决方法：(1) 电泳图谱不齐或分离不良这是电泳分析中最常见的问题，多数是由于血清滴加不均匀或滴加过多，也有因薄膜质量不合要求所致。点样这一步非常关键，一定要按操作步骤进行。首先选择质匀、孔细、染料吸附少的薄膜充分浸透缓冲液至湿度均匀无干白点。然后将滤纸吸去薄膜表面的多余水份，使薄膜含水量饱和均匀，这样才能防止薄膜表面液体含量不均，水份移动而引起标本移位。点样前注意关闭门窗和风扇，因空气流通快可使标本和水份蒸发而影响电泳图形。点样要力求做到均匀迅速。(2) 电泳图谱出现条痕 问题是由于点样后薄膜过干，或因电泳槽密闭性不良，或电流过大，温

9、度升高，薄膜水份蒸发干燥而造成的。因此薄膜一定要充分浸透后才能点样，并注意检查电泳槽是否盖紧，电泳槽要放在远离光源热源的阴凉之处。在电泳过程中随时观察电压电流的变化，因通电后产生一定的热量，电流会有所增加。控制电压 150160V，电流 0.50.6mA/cm，电泳时间一般冬长夏短，以区带展开 3.54cm 即可。(3) 区带拖尾（+） （-）- 4 -电泳后区带应无拖尾，各区带明显分开，如果电泳图谱分离不清或不整齐，最常见的原因有：点样过多；点样不均匀、不整齐，样品触及薄膜边缘；薄膜过湿，样品扩散；薄膜未完全浸透或温度过高导致局部干燥或水分蒸发；薄膜与滤纸桥接触不良；薄膜位置歪斜、弯曲，与电

10、流方向不平行；缓冲液变质；样品不新鲜；缓冲液的离子强度低于 0.05。(4) 区带一边长一边短呈现扭曲现象这是薄膜两边电阻不一样，电阻大的一边电流小，速度慢，区带展开短。造成这种现象的原因是薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻。在操作过程中，一定要注意使薄膜两端紧压在滤纸桥上。(5) 球蛋白区带倒退这是电渗作用引起的。可升高点样端的缓冲液面高度或适当加大电流量克服之。(6) 染色后白蛋白中间色浅有些同学在实验中往往急于求成，染色时间未到便匆忙取出薄膜漂洗，结果造成了白蛋白区带中间色浅的现象。造成这种现象的另一个原因是白蛋白含量过高。可增加染色时间或减少点样量解决之。(7)

11、染色后区带清晰度不良陈旧标本可使区带分离清晰度大为降低。应尽量当日标本当日做，最多不超过 2 天。另外标本不可溶血，因溶血标本中血红蛋白与 球蛋白的电泳区带相重迭。可造成 球蛋白含量升高而蛋白质含量相对减少的结果。(8) 白蛋白区带染色不均并有空泡这是染色液陈旧所致，染色液存放和使用过久，会降低蛋白质结合染料的能力。发现正在使用的染液已陈旧时，应立即全部弃去，更换新液。4、本实验的临床意义 正常血清蛋白电泳一般可分为 5 条区带，即血清清蛋白、1 球蛋白、2 球蛋白， 球蛋白、 球蛋白。脐带血清、胎儿血清、部分原发性肝癌血清，在血清清蛋白与 1球蛋白之间可增加一条甲胎蛋白带。多发性骨髓瘤可分离

12、出 6 条区带，多出的 1 条称为 M蛋白带。在下列疾病中可见醋纤膜蛋白电泳图明显异常： （1）M 蛋白血症单克隆 球蛋白 (M 蛋白) 血症，主要见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病以及一些良性 M 蛋白增多症。在 与 球蛋白后区段的各部分出现一条致密浓集的 M 蛋白带。 （2）蛋白缺乏症主要包括 1 抗胰蛋白酶缺乏症、 球蛋白缺乏症等。临床上较少见。电泳图型表现为 1 或 球蛋白部位蛋白缺乏或显著降低。 （3）肾病见于急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭等。表现为血清清蛋白降低，2 和 升高。 （4）急慢性炎症表现为 1 、2 和 三种球蛋白均增高。 （5）肝病包括急慢性肝炎和肝硬化。主要

13、表现为血清清蛋白降低、 和 球蛋白增高，出现 和 难分离而相连的“ 桥”，此现象往往是由于 IgA 增高所致， IgA 与肝纤维化有关。5、注意事项（1）选择质地均匀的薄膜。（2）点样量要适中，不能太多，也不能太少，而且要成粗细均匀的直线，否则影响电泳的结果。（3）电泳过程中注意监看电压，电流的情况。- 5 -【参考文献】1 王祖植.血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验条件及影响因素探索.上海医学检验杂志，1987；2(3)：1402 张军力.提高电泳图谱质量的几项要素.陕西医学检验.1993；8(1)：363 江苏省检验学血清蛋白电泳专业组.醋纤膜血清蛋白电泳规范化操作方法.临床检验杂志，1987；5(1) ：33