甘油的检测方法汇总.doc

1、 甘油的检测方法汇总在发酵行业中，甘油作为底物，是发酵液中生物合成的直接前体，会影响外源蛋白的启动表达效率，其含量的高低直接影响产物的发酵单位，是决定菌种取舍的重要指标，是提高工程菌的发酵密度，提高产品生产率的关键。在生物柴油生产中，它是副产物，其含量直接影响生物柴油的使用性能，是衡量生物柴油产品品质的重要指标之一。此外，甘油能与水结合以防止红细胞的冷冻损伤，能延长红细胞的保存期，被普遍用作细胞内冷冻保护剂等。由于甘油用途很广，因此其含量的测定具有非常重要的意义。目前国内外甘油含量的测定方法较多，主要有高碘酸氧化法、Cu 2 + 络合比色法、酶比色法法、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、气

2、相色谱法、近红外光谱法以及原子吸收法等。下面将对其进行简要概述：1、高碘酸法1.原理：高碘酸氧化法是目前常见用于甘油含量检测的方法，利用高碘酸与甘油发生氧化还原反应，剩余高碘酸及反应生成的碘酸与碘化钾反应生成碘，再用硫代硫酸钠进行滴定，根据消耗的硫代硫酸钠的量来计算甘油的含量。2.操作步骤准确发酵液 10ml 于 100mL 小烧杯中，加少量水溶解，然后转移至 100mL 容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀，静置。用移液管准确移取 10mL 上述溶液于碘量瓶中，加入 20mL 高碘酸钠溶液，混合均匀后，于黑暗中避光静置 40min，然后加入碘化钾溶液和 20%盐酸溶液各 15mL，调节 pH 值在

3、 0.81.0 之间，然后用硫代硫酸钠标准溶液滴定，近终点时，加入 2mL 淀粉指示剂溶液，继续滴定至溶液蓝色消失。同时做试样空白。3.计算： 10450/1w2MCV）（式中：w 样品中甘油的含量，；V1空白试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；V2试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；C硫代硫酸钠标准溶液的浓度，molL；M 甘油相对分子质量；2、酶比色法1.原理：它是利用酶的特异性催化反应建立的测定甘油的一种酶学方法，是指甘油在甘油激酶作用下转化为 3-磷酸甘油，后者由磷酸甘油氧化酶催化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢，然后过氧化氢和 4-氨基安普比林、4-氯酚在过氧化物酶催化下反应生成紫

4、兰色、能在 500 nm 左右有特征吸收峰的醌亚胺，通过颜色深浅即吸光度的变化测定所生成的 H2O2，甘油的含量与生成的 H2O2成正比，这样用比色法就可以测定甘油的含量。2.操作步骤波长：500nm (480520nm) 反映温度：37 比色杯光径：1cm 取一定量 R1(参看 R2 瓶签)加入 1 瓶 R2 中，溶解后即为工作液，工作液预先保温至测试温度。空白管 校准管 样品管工作液 1ml 1ml 1ml蒸馏水 0.01 0 0标准品 0.01样品 0 0 0.01分别混合均匀，在反应温度保温 10 分钟，以试剂空白管校零，记录校准及样品 OD 值。3.计算： 甘油浓度=A 样品 /A

5、校准 校准浓度（mmol/L 或 mg/dl） 3、高效液相色谱法1. 原理：高效液相色谱法( HPLC) 的原理是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，利用色谱柱对待测混合物先进行分离，然后再进行检测，从而实现对试样的分析，因而其测量的准确性和精确度较高，目前已成为检测生化分子较常用的一种方法。2. 操作步骤（1）首先用水将发酵液稀释 2.5 倍,然后加 H3PO4调 pH 至 5.5,在转速 8000r/min、温度 4下离心 10min,经微孔滤膜过滤用于 HPLC 分析；（2）将甘油标准系列溶液在最佳色谱条

6、件下进行 HPLC 分析,以峰面积外标法定量得到甘油标准曲线；（3）按照样品预处理方法处理后进样 5 微升,记录峰面积,代入线性方程中,计算其测定值。将计算值乘以稀释倍数后,即得发酵液中甘油的含量。4、气相色谱法1.原理：气相色谱分析法是用于分离分析复杂样品中的化合物的一种方法，其原理是一定量的气体或液体分析物被注入到柱一端的进样口中，在载气带动下通过色谱柱，分析物的分子会受到柱壁或柱中填料的吸附。由于不同的样品具有不同的物理和化学性质，与特定的固定相有着不同的相互作用，使得每一种类型的分子都有自己的通过速率，因此，分析物中的各种不同组分就会在不同的时间到达柱的末端，从而得到分离。当化合物从柱

7、的末端流出时，它们被检测器检测到，产生相应的信号，并被转化为电信号输出，从而确定每一个组分到达色谱柱末端的时间顺序以及每一个组分的含量。2.操作步骤（1）标准溶液的配制 在 7 个 25mL 容量瓶中分别准确称入0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g 甘油（精确至 0.1mg），再分别移入 2mL 内标贮备液，用混合溶剂定容并摇匀，作为标准工作溶液。其中甘油质量浓度分别为0、2、4、8、12、20g/L，内标质量浓度均为 8g/L。（2）样品的制备 在 25mL 容量瓶中加入 5ml 的发酵液样品，移入 2mL 内标贮备液，用混合溶剂定容至刻度并摇匀。（3）GC 条件色谱柱：H

8、P-5 石英毛细管柱，30m（柱长）0.32mm（内径）0.25m（膜厚）。柱温：初始温度 120，保留 5min，以 20/min 升至 290，保留 10min。进样口温度：280，进样量：0.2L，分流比：1001。检测器（FID）温度：300，氢气流速：40mL/min，空气流速：300mL/min。载气：氮气，流速：1mL/min，恒流模式（4）进样，计算5、酶电极法1、检测原理利用生物酶只能催化一种或一类底物的性质，将甘油氧化酶进行固定化处理，样本中的甘油在甘油酶膜的作用下被催化生成过氧化氢，根据电化学的原理，过氧化氢的浓度与电压值正相关，根据标准液、缓冲液的电压值响应值来确定样本

9、中甘油浓度。甘油浓度与电压值相关性分析2.操作步骤 按相关操作说明进行。整个检测过程不超过 45 秒应用范围：发酵过程甘油浓度检测，食品中甘油检测，西尔曼科技有限公司国内唯一一家有能力生产可以不用预稀释样本就可以检测高达1甘油浓度的分析的制造商。6、总结甘油的测定方法很多,最常用的是化学法。化学法测定甘油含量费用较低,但操作繁琐,试剂用量大,耗时长,且有时误差极大。酶法测定甘油专一性强,只与溶液中的甘油特异性地反应,但所需试剂昂贵,不利于工业应用和大量样品的检测。测定游离甘油最灵敏的方法是气相色谱法、液相色谱法，精确度较高，但需对甘油进行硅烷化，操作麻烦，成本也较高。由于高碘量法受发酵液中的杂质（糖类、多元醇）影响大，特别是发酵中甘油含量低时，单用此方法检测基本不准确；高效液相色谱法检测准确，但发酵样品前处理工作量大，不适合产生大量样品的。因此使用酶电极法测定发酵液中甘油含量，具有速度快、专一性强，由于固定化酶可以重复利用，单次检测相对于酶比色法具有更低的成本。