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1、第九章,丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) Ser/Thr蛋白激酶 受细胞外刺激而激活 在所有真核细胞中高度保守 通路组成 三级激酶模式 调节多种重要的细胞生理/病理过程,本章主要内容： MAPK 信号通路的成员 MAPK的蛋白结构 MAPK通路模式 MAPK的激活 MAPK信号转导通路间的关系,一、MAPK 信号通路的成员 MAPK是信号从细胞表面核内的重要转递者。已鉴定的 (据1999的统计)： MAPK激酶激酶 (MKKK) 14种 MAPK激酶 (MKK) 7种 MAPK 12种,MKKK(M

2、AP Kinase Kinase Kinase) 亚族：,MKK (MAP Kinase Kinase)亚族：,MAPK (MAP Kinase)亚族：,二、MAPK的蛋白结构（一）MAPK的一级结构 苏氨酸磷酸化位点与其他蛋白激酶同源，酪氨酸磷酸化位点是MAPK独特的。 磷酸化位点的三肽模体 TXY ERK和ERK5 TEY p38 TGY JNK TPY, 三肽模体位于L12 各亚族L12长度不同 活化唇 (activation lip) 各亚族都具有12个保守亚区 真核细胞蛋白激酶超家族区分标志之一 家族成员之间具有较高的同源性,哺乳动物MAPK,哺乳动物MAPK,（二）MAPK的二级结

3、构和超二级结构 以ERK2为例 N端域 主要由折叠和2个螺旋组成 （1109和320358位氨基酸残基） C端域 螺旋，含磷酸化唇和MAPK插 入，催化环（Arg-147152) （110319位氨基酸残基） 交界处的裂隙 ATP结合位点,（三）MAPK的空间结构特征大体结构：非常相似底物结合口袋的结构特征： 无活性时被阻断，有活性时暴露出。ATP结合位点的结构特征： 大小、形状、疏水性和电荷等不同磷酸基团结合位点： 4个保守位点,三、MAPK通路模式,四、MAPK的激活MAPK激活机制的发现重要的实验观察： 20世纪80年代，观察到当GF刺激时，Tyr被磷酸化的主要蛋白为42kDa 佛波酯醇

4、刺激时，产生同样的蛋白 胰岛素RTK催化Ser/Thr蛋白激酶 胰岛素刺激，产生Thr和Tyr双磷酸化的42kDa蛋白,MAPK的激活机制 活性部位位于两个折叠域的界面 是通过Thr和Tyr的双位点同时磷酸化而被激活 例：ERK2 Tyr-185 , Thr-183 pY185 解除L12对底物结合的阻断 MAPK是Pro指导的蛋白激酶,对于ERK2来说，其底物的一般保守性序列为 Pro-X-Ser/Thr-Pro 活化环中Tyr-185 和Thr-183的磷酸化， 引起该环重新折叠，与Arg结合位点相互作用 酸性氨基酸替代，不导致组成性活化 MAPK的点突变不影响其活性,五、酵母MAPK通路

5、 酿酒酵母 已鉴定出5条 单倍体的交配途径 浸润性生长通路 细胞壁重构通路 双组分渗透压感受器通路 Sho1渗透压感受器通路,（一）酵母菌中MAPK模式的组成和作用 酿酒酵母：4种MKKK 4种MKK 6种MAPK 其中，4种参加明确的5种MAPK通路 2种 (SMK1, YKL161C)参加未知的MAPK通路 3个成员通过与支架蛋白结合而联在一起,（二）单倍体酵母与交配有关的通路 酿酒酵母的2种交配型(单倍体)： a细胞型和 细胞型 2种性信息素：a因子和 因子 7次跨膜受体：Ste3和 Ste2 异三聚体G蛋白： Gpa1 亚基 Ste4 亚基 Ste18 亚基,Ste2 receptor

6、,酿酒酵母的交配通路,ste：不育基因 Ste5：支架蛋白Ste12： 转录因子,支架蛋白 ( Scaffold protein) 其主要功能是将其他蛋白质结合在一起，促进它们相互作用。 将细胞信号通路中的各种信号分子结合在一起，形成复合物 起生理性隔室化的效应,从而防止该通路与其他通路发生交联 含有许多蛋白结合域,（三）浸润通路 缺乏氮源 形态改变假菌丝： 缺乏氮源时，椭圆型的双倍酵母进行不对称的细胞分裂以产生一个细而长的子细胞，后者又不断产生长的子细胞。由于母细胞与子细胞仍然相连，因此这种单级分裂方式的不断重复将产生由延长的细胞组成的丝状物。,KSS1： 丝状生长所需要(单倍体，双倍体)注

7、： 未被Ste7激活时，是浸润生长的抑制物，被Ste7激活时，刺激浸润生长。,FUS3和KSS1的鉴别： 刺激激活的条件不同 FUS3 信息素 KSS1 缺乏氮源 表达不同 FUS3 单倍体细胞中 KSS1 单倍体细胞和双倍体细胞中 对浸润生长的调节作用 FUS3 抑制 KSS1 刺激,（四）细胞壁重构通路, 酵母的生长依赖于有效的细胞壁重构 PKC1：MKKKK MKK1和MKK2的重叠作用意义不清,（五）渗透压感受器和应激通路 酿酒酵母的2种渗透压感受器： “双组分”渗透压感受器 低渗透压条件下激活 膜渗透压感受器 高渗透压条件下激活 2种渗透压感受器对MAPK通路的调节 作用不同,1.

8、“双组分”渗透压感受器 “双组分”转导体系通常见于原核细胞 “双组分”转导体系的组成 感受器分子 胞外区 + 胞质His激酶域 + 反应-调节分子 接受域 + DNA结合域 是一种His-Asp磷酸化体系 “双组分”转导体系在哺乳类尚未鉴定出, “双组分”转导过程 感受器蛋白活化 胞质激酶域的His磷酸化 反应-调节分子接受域 的Asp磷酸化 启动输出功能，即转录激活作用,酵母 “双组分”渗透压感受器： 由3种蛋白组成 Sln1 + Ypd1 +Ssk1 两个相连的“双组分”体系 第一个 Sln1(His激酶域和接受域) 第二个 Ypd1 (His激酶域) + Ssk1 (接受域),在低渗透压

9、条件下 Sln1 是有活性的 Ssk1是无活性的 HOG1也无活性在高渗透压条件下 Sln1 是无活性的 Ssk1是有活性的 HOG1也有活性,2. Sho1依赖的渗透压感受器 Sho1：跨膜蛋白渗透压感受器 结构 ：4个跨膜区 + C-末端胞质区 ( 含SH3域),在高渗透压条件下 Sho1 感受高渗透 Sho1激活Ste11 Pbs2发挥支架蛋白的作用 Pbs2含有多聚脯氨酸富集区,3. 裂殖酵母菌中的渗透压感受通路和 应激通路 环境应激时激活2个相关的MAPK通路 WIK/WIS/SPC1通路 WIN1/WIS/SPC1通路 (在渗透压应激时起主要作用) 上游调节因子Mcs4是Ssk1蛋

10、白的同源物 ATF1是SPC1的主要核内底物, SPC1只有经磷酸化后才能入核 热休克和氧应激时SPC1磷酸化激活，但不需要WIS的作用。 Pyp1使SPC1脱磷酸化,（六）芽孢形成通路芽孢形成：是指将单倍体核包装入芽孢的过程 包括减数分裂。 仅发生在双倍体 由饥饿诱发 芽孢形成过程： 减数分裂 双层膜的原孢子壁包裹单层核膜的4个单倍体 从原孢子壁的双层间隙沉积孢子壁。,孢子壁的组成：共4层： 第一、二层：同植物细胞壁 第三层：孢子特异性的结构 聚乙酰氨基葡糖 + 聚氨基葡萄糖 第四层：电子密集层 双酪氨酸包被,从以上酵母MAPK通路的研究中看到: MAPK通路是一个连续的蛋白激酶激活的途径

11、MAPK的主要底物为转录因子 MAPK通路受不同的上游因子调节 信号转导是高度特异的 某一种蛋白成员存在于数种通路时,支架蛋白起着隔室化的作用,六、哺乳动物MAPK通路 哺乳动物MAPK通路不同于酵母: 多种MAPK通路可被一种受体型所激活 MAPK的主要底物包括转录因子、 胞 质蛋白质 、细胞骨架、蛋白激酶和磷脂酶 已鉴定出4条MAPK通路 MAPK有多种亚族和多种不同的剪接体,（一）ERK通路 研究得最为透彻 ERK的MAPK有5种 (15) 它们分属于不同的亚族 ERK1和ERK2(ERK1/2)研究得最为透彻 为细胞内主要的MAPK ERK3存在于细胞核 ERK4通过Ras依赖性通路而

12、被激活,1. ERK1/2通路中MKKK 许多受体通过活化Ras激活ERK1/2通路Raf: 是该通路中的重要的MKKK 亚型: 有3种 A-Raf 、 B-Raf 、 Raf1 组成: 含3个结构域 C-末端的激酶域 富含Cys的调节域 含Ras结合位点的调节域, 表达: Raf1在体内广泛表达 而A-Raf 和B-Raf表达方式严格 如B-Raf 主要在神经组织中表达 激活: 酶水平的调节较复杂 主要包括2个过程: 一是结合于GTP- Ras 二是 磷酸化 ( 一簇 Ser338, Ser339, Tyr340, Tyr341),Raf1对于H-、K-和N- Ras显示应答 B-Raf 可

13、被Rap1a活化 TC21能够与Raf1和B-Raf相互作用，激活它们。 上游激酶的调节: 已知磷酸化Raf1的激酶有Src 、PAK、PKC及其他蛋白激酶, 其他的磷酸化位点 Ser259和Ser621 调节Raf1与14-3-3蛋白结合，稳定其活性。不过， 14-3-3蛋白也可能抑制Raf活性。抑制性的磷酸化位点是由Akt (Ser259)和PKA催化的。 抑制：RKIP可干扰Raf-MEK的结合，抑制后者磷酸化和活化。,2. ERK1/2通路中MKK (MEK) MEK1和MEK2是该通路主要的MEK 为双特异性蛋白激酶 通过两个残基的磷酸化而被激活 ( Ser或Thr) (同MAPK)

14、 突变可引起其活性增加(不同于MAPK) 酸性氨基酸替代，明显增加其活性 特异性较高，仅磷酸化少数底物, MEK4可磷酸化非MAPK MEK1和MEK2含3个非酶活性结构域 ERK1/2结合位点 ( D域 ) 富含Pro结构域 核输出序列 ( NES ), MEK1和MEK2的上游调节因子 Raf、RTK、非RTK、GPCR在转化细胞： Ras Raf1 MEK1 ERK1/2在心肌细胞 A-Raf MEK1 ERK1/2在PC细胞 B-Raf MEK1 ERK1/2,3. ERK1/2蛋白激酶的作用底物及灭活 底物的保守性磷酸化位点模体为 Pro-Lue-Ser/Thr-Pro 底物蛋白 胞

15、质蛋白: p90S6K 、cPLA2 、EGF 受体 细胞骨架: MAP1、2 、4 、Tau 转录因子：Elk-1, Ets-1, Sap1a, c-Myc等 灭活: MKP-1, -3, -4,4. ERK1/2通路的生物学功能 刺激细胞增殖 抑制细胞生长、分化 细胞周期调控 调控MTOC 纺锤体的组装 促进细胞存活 某些情况下，与细胞死亡有关,（二）JNK信号转导通路 1991年鉴定出的新的MAPK 与ERK有两点不同： 被紫外线辐射等细胞应激所激活 磷酸化c-Jun的氨基活化位点 故称之为c-Jun N-terminal kinase (JNK) 鼠的同源物则被命名为Stress ac

16、tivated protein kinase (SAPK)。,之所以称为SAPK是因为在应答各种刺激时，它们的活性增加。这些应激包括： 细胞因子 生长因子撤离 干扰DNA和蛋白合成的试剂 UV辐射 热休克 反应活性氧 (ROS) 高渗透压,JNK信号转导通路 是已知的应答最多样刺激的细胞信号转导途径之一 JNK通过Thr-Pro-Tyr模体的磷酸化被激活 由JNK、 MAP2Ks、 MAP3Ks 和MAP4Ks组成 细胞外配体应答的JNK通路照比细胞应激应答研究得较为清楚,JNK： 人的JNK由3个基因 ( jnk1, jnk 2和 jnk3)编码 3个基因转录产物的不同剪接产生10个JNK亚

17、型 (46kDa, 55kDa) JNK家族成员间的激酶催化核心的同源性为87% 同一基因编码的46kDa和55kDa亚型无明显的功能差异, JNK1和JNK2广泛地在多种组织表达 JNK3 主要在神经组织表达 JNK1和JNK2 在激酶域的不同剪接体可改变JNK与它们底物的相互作用 不同的亚型受不同的调节,JNK底物包括： 转录因子 c-Jun, Jun-D, ATF-2, ATF, Elk-1 Sap-1a, GABP, GABP 肿瘤抑制蛋白p53JNK生理功能： JNK1和JNK2有重叠功能，在免疫应答和胚胎发育中具有重要的调节作用。 JNK3在神经组织中有特异功能,1. JNK信号通

18、路MKK和MKKK MKK (MAP2Ks) MKK4 ( SEK1/MEK4/JNKK1/SKK1 ) 主要激活JNK，但对p38也有活化作用 可能是个抑癌基因 胚胎发育所必需 使细胞免于凋亡 不是惟一的激活剂, MKK7 (MEK7/JNKK2/SKK4 ) 特异地激活JNK，而不激活p38或ERK 与MKK4相关，属于哺乳动物细胞MAPKK超家族 与果蝇的HEP(DJNK的激活剂)密切相关 MKK7基因编码6个蛋白亚型 不同亚型应答不同的细胞外刺激和上游激酶,MKK4与MKK7在人和鼠组织中广泛表达，但在不同的组织起表达的丰度不同 MKK4与MKK7介导来自同一细胞外刺激的信号转导，但它

19、们被不同MAP3Ks所激活。 同MEK1/2，用酸性氨基酸置换磷酸化位点的氨基酸，可增加其激酶活性。,MEKK (MAP3Ks)包括： MEKK14、 ASK1/MAPKKK5 MAPKKK6、 TAK1 Tpl-2 、 MLK2/MSK MLK3/SPRK/PTK1 MUK/DLK/ZPK LZK, MEKKs ( MAPK/ERK kinase kinases ) 因与酵母的STE11同源而被克隆 首先鉴定出的激活JNK的MAP3K是MEKK1 目前已克隆的4种称为MEKK14 在蛋白C-末端具有同源的激酶域，而它们的N-末端几乎无同源性, MEKK1和4与G蛋白Cdc42和Rac相互作用

20、 MEKK1还可结合Ras MEKKs 也调节其他细胞信号转导途径 MEKK13激活ERK通路 MEKK34激活p38通路, TAK1 ( TGF-activated kinase) 因其在芽殖酵母中具有回补STE11突变体缺失的功能而被克隆 N-端具有激酶域 C-末端与TAB1/2相互作用 被TGF- 、IL-1、神经酰胺、UV激活 可直接激活IKK和NF-B转录活性, ASK1/MAPKKK5 ASK2/MAPKKK6 ( Apoptosis signal-regulating kinase1) 应用PCR技术而被鉴定出 激酶域位于蛋白分子的中间 ASK1 MKK4 JNK ASK1 MK

21、K3 p38 被TGF- 、FasL激活 诱导凋亡,ASK2/MAPKKK6 ASK1的相关激酶 (鼠的同源物是ASK2) 应用酵母双杂交技术而被鉴定出 整个分子与ASK1的同源性为45% 但激酶域的同源性高达82% 与MEKK14的同源性约为40% 仅能较弱地激活JNK，但并不能 激活p38, Tpl-2/cot ( Tumor progression locus 2) 最初作为原癌基因而被克隆 与人的cot基因约有90%的相同性 与其他的MAP3K约有30%的相同性 Tpl-2 MEK1 ERK Tpl-2 MKK4 JNK 参与NF-B的激活, MLKs ( Mixed lineage

22、kinase) 该家族激酶的特点： 催化域具有Tyr和Ser/Thr两种蛋白激酶的结构特点 N-端含有SH3模体 C-端有Pro富集区 C-端附近有亮氨酸拉链, MLK2/MST ( mammalian STE 20-like) MLK2 MEK4 JNK MLK2 MKK7 JNK 对p38和ERK的作用较弱 含有Cdc42和Rac的结合位点 MLK3/SPRK/PTK MLK3 MKK4 JNK MLK3 MKK3/6 p38 对ERK无作用, MUK/DLK/ZPK/LZK ( MAPK- upstream kinase) ( dual luecine zipper- bearing k

23、inase) (luecine zipper- protein kinase) (luecine zipper- bearing kinase) MUK MEK7 JNK LZK激活JNK,MAP4Ks STE20相关激酶 N-端具有STE20样的催化域 中间至少有2个Pro富集域 C-端有CNH域 是JNK强的特异性激活剂 GCK ( germinal center kinase) KHS (kinase homologous to STE20 ) GCKR (GCK- related kinase) GLK (GCK like kinase), TAO1 ( Thousand and on

24、e amino acid protein kinase) 应用PCR方法从大白鼠脑的cDNA文库中鉴定出。 主要在脑和睾丸中表达 激酶域与其他STE20相关激酶的同源性约45% 主要激活MKK3, HPK1 ( hematopoietic progenitor kinase ) 主要在造血细胞中表达 含有4个Pro富集域 与连接物蛋白相互作用 受酪氨酸蛋白激酶调节 主要激活JNK，不是ERK和p38 在TGF- 诱导的JNK激活中是TAK的上游,支架蛋白： 在哺乳动物细胞中了解有限 JIP1 ( JNK-interacting protein 1 ) 应用酵母双杂交筛选出 主要结合JNK，不是

25、ERK和p38 抑制JNK的核转位 结合MKK7 与MLK家族、HPK1相互作用,（三）p38信号转导通路 p38最初作为LPS刺激产生的酪氨酸磷酸蛋白而被鉴定出 p38与酵母HOG1具有明显的同源性 p38是细胞抑制性抗炎药的靶分子 双磷酸化三肽模体 Thr-Gly-Tyr 不同亚型的表达、激活和特异性不同 亚型之间有重叠的、不同的生理作用,p38的表达： p38 ：白细胞、肝、脾、骨髓中等高表达 p38 ：脑和心中高表达 p38 ：主要在骨骼肌中表达 p38 ：肺、肾、肠及内分泌器官中高表达注： p38 和 p38 具有不同的剪接体 例：Mxi 缺少80氨基酸残基的p38 ,p38的结构：

26、 N-末端、C-末端延伸短，与已知其他激酶无同源性 (p38家族成员和JNK亚型除外) 相似于ERK2，但活化环构象差异明显 ATP结合位点相对开放 磷酸化唇序列比ERK2短6个氨基酸残基,1. p38 信号转导通路的MKK和MKKKMEKs: MEK3和MEK6是细胞中p38激活的主要激酶。 不同的MEK选择性地激活不同的亚型 MEK6 共同的激活剂 MEK3 激活 p38 , , ,MEKKs: MEKK13参与p38激活 MEKK1MEK4 p38 (3T3细胞) MEKK3MEK3 p38 (转化细胞) MLK家族的4个成员参与p38激活 其他激酶 Tp12 ASK TAK,MLK家族

27、成员含有3个结构域： SH3域 亮氨酸拉链 小分子G蛋白结合域参与p38激活的4个成员是： MUK/ZPK/DLK MTK1/MEKK4 MLK2/MST MLK3/PTK/SPRK,上游调节因子： Rac、Cdc42、Rho家族的小分子GTPase是p38途径的较强的调节因子。 Rac/Cdc42 PAK p38,来自细胞表面的活化： 异三聚体G蛋白可激活p38途径，但激活机制因细胞不同而异。 M1-乙酰胆碱受体-Gq/11 M2-乙酰胆碱受体-Gi -肾上腺素受体-Gs (HEK293细胞) 1A-肾上腺素受体-Gs (PC12细胞) -肾上腺素受体-Gi (ARVM细胞),激活p38途径

28、的物理、化学应激： 氧化应激 (巨噬细胞 ) 低渗压 (HEK293细胞 ) 紫外线辐射 (PC12细胞 ) 低氧 (牛肺动脉成纤维细胞 ) 循环扩张 (肾小球膜细胞 ),亚细胞定位： 细胞核、胞质 (免疫荧光显微镜) 应激反应，如心肌缺血、低氧时， 胞质 核p38的抑制剂： 吡啶咪唑 结合于ATP结合位点延伸袋 p38 , 敏感 p38 , 不敏感,2. p38蛋白激酶的作用底物和灭活作用底物: 细胞骨架 细胞应激 微管相关蛋白(tau) stathmin ( 癌蛋白18） 细胞质蛋白 刺激血小板 cPLA2 血管紧张素 Na+/H+交换体, 转录因子 ATF1/2 (activation

29、transcription factor 1/2) CHOP10 (C/EBP-homologus protein 10 ) MEF2C (myocyte enhancer factor 2C) Max (myc associated factor X ) MAPKAPK 2/3 MNK1/2 (MAPK-interacting kinase 1/2 ) PRAK (p38-regulated/activated kinase),p38蛋白激酶灭活： 蛋白激酶磷酸酶M3/M63. p38 信号转导通路的功能 主要参与应激反应，此外 血细胞细胞因子的生成 (单核细胞：IL-1，TNF-) 细胞凋

30、亡 免疫反应调控,p38亚型的作用： p38 ：特异地参与LPS介导的细胞反应 如黏附、NF-B活化、TNF-合成 诱导凋亡 p38 ：促进细胞存活 总之， p38在细胞增殖、分化和生存过程中起作用。,（四）MKK5/ERK5通路ERK5 (BMK, big mitogen- activated kinase)： MAPK家族中分子量最大的成员 故有BMK之称 与ERK2有52%的同源性 双磷酸化三肽模体为TEYMEK： MEK5 (, 两种亚型),活化和上游调节因子 生长因子 应激 (如氧化应激、高渗透压 ) 血清 Src和Ras是ERK5信号转导途径的调节因子 GPCR (Gq和G12/1

31、3)也调节ERK5活性 MKKK MEKK3、Tpl-2,ERK5的作用底物： MEF2家族 (A, C, D) Ets样转录因子Sap1a ( serum response factor acessory protein 1a)抑制剂： 无特异性的抑制剂 MKP1/3 使MEK5脱磷酸 高浓度PD98059和U0126抑制MEK5活性,（五）孤儿MAPK1. ERK3亚型 研究最少 分为 ERK3 和 ERK3 (74%同源性) 单一磷酸化位点 (Ser) 组成性定位于核,2. ERK7亚型 催化区与ERK2有40%的同源性 双磷酸化三肽模体 Thr-Glu-Tyr 具有自我调节功能 氯通道

32、相关蛋白可与非催化区结合 ( chloride intracellular channel protein 3 CLIC3),2. NLK ( Nemo-like kinase) 催化区与ERK2有超过45%的同源性 缺少Tyr磷酸化位点 Lit-1 (线虫的同源体) 是Mom-4 (蠕虫TAK1的同源体) 的下游 下调Wnt信号,2. MOK ( MAPK/MAK/MRK overllaping kinase) 与ERK2有30%的同源性 双磷酸化位点 佛波酯醇和OA增加其活性 相关激酶 MAK ( male germ cell associated kinase) MRK ( MAK-related kinase),