阴道分泌物和相关病原体的检验.ppt

1、1,提纲阴道分泌物检验概述标本采集阴道分泌物的常规检查病原学检验阴道毛滴虫真菌细菌（革兰氏染色,加德纳菌,淋球菌梅毒螺旋体）沙眼衣原体支原体 病毒( HSV,CMV, HPV, HIV),2,概述阴道分泌物：由女性阴道流出的、有粘性的、乳白色液体，俗称白带。由前庭大腺、子宫颈腺体、子宫内膜的分泌物和阴道粘膜的渗出液、脱落的阴道上皮细胞混合而成。性行为中，白带会增多，对阴道有润滑作用；一般月经中期，稀薄透明；排卵后白带又变粘稠，混浊而量少。其检测常用于生殖系统炎症、肿瘤的诊断及雌激素水平的判断。阴道的自洁：白带中含有乳酸杆菌，复层上皮细胞所含糖原经乳酸杆菌作用后，使阴道的环境保持为酸性状态，同时

2、白带中还含有溶菌酶和抗体，故有抑制细菌生长的作用。,3,标本采集（妇产科医师进行）24小时前禁止性交、盆浴、阴道检查、阴道灌洗及局部用药；取材所用消毒的刮板，吸管或棉拭子必须清洁干燥，不粘有任何化学药品或润滑剂；根据不同的检查目的可自不同部位取材。一般采用盐水浸湿的棉拭子自阴道深部或阴道穹后部、宫颈管口等处取材；生理盐水悬滴可检查滴虫，涂制成薄片以 95% 乙醇固定，经过巴氏染色、吉姆萨染色或革兰氏染色，进行肿瘤细胞筛查或病原微生物检查。,4,阴道分泌物的常规检查外观 正常为白色稀糊状，无气味、量多少不一，与雌激素水平及生殖器官充血情况有关。排卵期多，清澈透明、稀薄似蛋清；排卵后2-3天量减少

3、，并变为混浊粘稠；行经前量又增加；妊娠期量较多。 外观异常可见于：大量无色透明粘白带：雌激素水平过高，如用雌激素药物后及卵巢颗粒细胞瘤脓性白带：滴虫或化脓性感染泡沫状脓性白带：滴虫性阴道炎豆腐渣样或凝乳样白带：真菌性阴道炎血性白带：肿瘤、宫颈息肉、老年性阴道炎、重度慢性宫颈炎、及其它原因引起的出血,5,PH正常为PH4-4.5，阴道内呈弱酸性，这是阴道的自净作用，可以防止致病菌繁殖。如果患有滴虫性或细菌性阴道炎时，pH值上升，可大于56。 pH增高还见于幼女及绝经后的妇女。,6,清洁度检查 将阴道分泌物加生理盐水作涂片，用高倍镜检查，主要依靠白细胞、上皮细胞、阴道杆菌与杂菌的多少划分清洁度。

4、度 大量阴道杆菌和上皮细胞，白细胞 0-5/HPF ，杂菌无或极少。正常度 中等量阴道杆菌和上皮细胞，白细胞 10-15/HPF ，杂菌少量。 亦属正常 度 少量阴道杆菌和上皮细胞，白细 胞 15-50/HPF ，杂菌较多。 提示有炎症 度 无阴道杆菌，有少量上皮细胞，白细胞 50/HPF ，大量杂菌。 多见于严重的阴道炎,7,正常清洁度为I-II级临床意义:病原菌感染，清洁度降低；如果未见病原菌，则为非特异性阴道炎卵巢功能减退，清洁度降低局限性： 1 分级指标不够，级别不够详细，难以实际运 用； 2 不能真正反映阴道清洁状况； 建议淘汰清洁度分级而代之以涂片染色，具体报告所见情况。,8,病原

5、学检查阴道毛滴虫(TV) 引起阴道感染的病原体主要是阴道毛滴虫，可致滴虫性阴道炎。 病人外阴灼热痛、瘙痒，阴道分泌物呈稀脓性或泡沫状。,9,检测方法 1 直接涂片 将分泌物用生理盐水悬滴法置于低倍显微镜下观察，可见波动状或螺旋状运动的虫体将周围白细胞或上皮细胞推动。虫体大小为8-45 um，在高倍镜下观察，呈顶宽尾尖倒置梨形，大小多为白细胞的 2-3 倍，虫体顶端有前鞭毛 4 根，后端有尾鞭毛一根，体侧有波动膜，借以移动。阴道分泌物的清洁度常为-度。 注意事项 阴道毛滴虫生长繁殖的适宜温度为 25-42 摄氏度，故在检验时应注意保温，方可观察到阴道 毛滴虫 的活动。 在阴道分泌物中见到阿米巴滋

6、养体时，提示为阿米巴性阴道炎,10,2 涂片染色 固定染色后呈梨形，体长8-45m，前端有一个泡状核，核上缘有5颗排列成环状的毛基体，由此发出5根鞭毛，其中4根前鞭毛，1根后鞭毛。 3 胶乳凝集快速检查4 培养法,11,真菌 阴道真菌有时在阴道中存在而无害，在阴道抵抗力减低时容易发病，真菌性阴道炎以找到真菌为诊断依据，阴道真菌多为白色假丝酵母菌，偶见阴道纤毛菌、放线菌等。 患者外阴瘙痒、灼痛。严重时坐卧不宁、痛苦异常。还可有尿频、尿痛及性交痛。急性期分泌物增多，典型的白带呈白色稠厚豆渣样。检查可见小阴唇内侧及阴道粘膜上附着白色膜状物，擦除而露出红肿粘膜面。急性期可见到白色膜状物覆盖下的糜烂面及

7、浅表溃疡。,12,检测方法：1 湿片检查 标本置于载玻片上，加一滴2.5mmol/L KOH溶液，盖上盖玻片，置于显微镜下检查。先在低倍镜下初步检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜以孢子和菌丝的形态特征鉴别。2 涂片染色 孢子呈卵圆形，比葡萄球菌大56倍，革兰氏染色阳性，着色不均匀。常见出芽，生成假菌丝，假菌丝长短不一。3 培养 血琼脂或沙保氏琼脂培养基。,13,细菌1 湿片检查法 取出的白带加无菌生理盐水一滴，在低、中倍显微镜下观察杆菌、球菌的比例。比较粗略，容易漏掉重要致病菌。2 干片染色法 取出白带均匀涂抹在载玻片上，晾干后革兰氏染色（或美兰、复合染色）后，油镜下观察染色特性，细菌形态。 现

8、在很多医院使用的妇科白带多功能染色液染色速度快，着色效果好，而且可同时观察真菌、滴虫、核异质细胞，所以逐步普及。3 分离培养。白带的细菌分离培养价值不太大，因为病原菌多，是否致病与阴道内环境关系密切。较常做的是淋球菌培养。4 特异生化反应。,14,革兰氏染色 细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，由丹麦医生汉斯克里斯蒂安革兰（Hans Christian Gram，1853年1938年）于1884年所发明。 原理 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上

9、它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。,15,革兰氏染色结果 革兰氏阳性菌体都呈紫色，阴性菌体都呈红色。 乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等 属革兰氏染色阳性菌；德纳杆菌、流感嗜血杆菌、百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等属革兰氏

10、阴性。,16,实验方法 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。,17,加德纳菌革兰氏阴性或染色不定的球杆菌，和某些厌氧菌共同引起细菌性阴道炎。加德纳细菌性阴道病的诊断依据：线索细胞20%PH4.5；胺试验：分泌物加2.5mmol/L KOH溶液时出现鱼腥气味；匀质、稀薄、灰白色阴道分泌物，可有臭味或鱼腥味。,18,淋

11、球菌 革兰氏阴性双球菌，是常见的性病病原菌之一。常引起化脓性感染，但部分患者表现为慢性带菌状。检测方法涂片染色法 取宫颈管内分泌物涂片，用革兰氏染色或美兰染色镜检，在多形核细胞中找到肾形双球菌。检出率低，易被阴道内的其它双球菌干扰，报告方式：找到（革兰氏阴性）双球菌培养法：WHO推荐方法，诊断淋球菌感染的金标准。直接荧光抗体染色：特异性欠佳其它：基因探针、PCR等,19,梅毒螺旋体 亦称苍白螺旋体(Treponemiapallidum，TP) ，菌体细长,带均匀排列的612个螺旋，体外人工培养较难。它可存在于梅毒患者皮肤粘膜硬下疳、皮疹、体液中。当与健康人性接触时，螺旋体就随分泌物进入健康人体

12、有破损的皮肤粘膜（即使是很细微的肉眼看不见的损伤），而使接触者受到感染 。,20,检验方法 1 暗视野显微镜检 由于显微镜下没有明亮的光线，便于检查苍白的螺旋体。这是一种病原体检查，对早期梅毒的诊断有十分重要的意义。,21,2 梅毒血清学检测 梅毒血清学检查对于诊断二期、三期梅毒，以及判定梅毒的发展、痊愈、判断药物的疗效都有十分重要的意义。包括： 非梅毒螺旋体血清学试验 这类试验的抗原成分为心磷脂、卵磷脂和胆固醇的混悬液，用来检测抗心磷脂抗体。由于这些试验具有相同的标准化抗原，所以敏感性相似。常用的有三种：性病研究实验室玻片试验（VDRL）；血清不加热的反应素玻片试验（USR）；快速血浆反应素

13、环状卡片试验（RPR）。可用作临床筛选，并可作定量，用于疗效观察。优点是快速、低廉。,22,梅毒螺旋体血清学试验 包括有：荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）；梅毒螺旋体凝集试验（TPHA、TPPA）；梅毒螺旋体制动试验（TPI）等。这类试验特异性高，主要用于诊断试验，但不能判定治疗效果，因为一旦患有梅毒，这一试验将终身阳性。 但还是有假阳性问题存在。可造成TPHA阳性的疾病有：类风湿性关节炎、红斑狼疮、糖尿病、结肠癌、淋巴肉瘤、丙型肝炎、肝硬化、AIDS、麻风、生殖器疱疹、海洛因成瘾等。,23,3 梅毒螺旋体IgM抗体检测 梅毒螺旋体IgM抗体检测是近年来才开展的新的诊断梅毒的方法。Ig

14、M抗体是一种免疫球蛋白，用它来诊断梅毒具有敏感性高，能早期诊断。 特异性IgM类抗体的产生是感染梅毒和其他细菌或病毒后机体首先出现的体液免疫应答，一般在感染的早期呈阳性，随着疾病发展而增加，IgG抗体随后才慢慢上升。经有效治疗后IgM抗体消失，IgG抗体则持续存在， 此外，TP-IgM的检测对诊断新生儿的先天性梅毒意义很大，因为IgM抗体分子较大，其母体IgM抗体不能通过胎盘，如果TP-IgM阳性则表示婴儿已被感染。,24,4 分子生物学检测 PCR要求有条件绝对好的实验室和技术一流的技师，而我国目前很少有这样高水平的实验室。,25,沙眼衣原体目前最流行的性传播疾病之一。检测方法：培养法 用感

15、染组织的渗出液或刮取物，接种鸡胚卵黄囊或传代细胞，分离衣原体，再用免疫学方法鉴定。难度大衣原体细胞学检查 直接涂片，Giemsa、碘液或荧光抗体染色镜检，查上皮细胞浆内有无衣原体或包涵体。特异性及敏感性差衣原体抗原检测 ELISA或免疫荧光法血清学试验 主要用于性病淋巴肉芽肿的辅助诊断。常用补体结合试验，若双份血清抗体效价升高4倍或以上者，有辅助诊断价值。也可用ELISA、凝集试验。5 PCR法,26,支原体生殖道支原体主要有解脲支原体和人型支原体。解脲支原体为脲原体属中唯一的一个种，因生长需要尿素而得名。分解尿素为其代谢特征，产生氨氮，使培养基pH上升。主要通过性生活传播，初期患者大多无明显

16、症状，后期可引起可引起生殖系统炎症，是女性不孕不育的重要原因。,27,检测方法1 高倍显微镜直接检查法2 分离培养法 准确度高，可同时进行药敏试验。首选方法，金标准。3 斑点免疫结合试验检测抗原或DNA 简便、快速、特异。4 血清学试验 5 PCR法,28,病毒单纯疱疹病毒（HSV）根据抗原性的差别目前把该病毒分为I型和II型。I型主要由口唇病灶获得，II型可从生殖器病灶分离到。感染是由于人与人的接触。是最易侵犯人的一种病毒，但在临床仅有一部份发病。II型疑疱疹病毒与人类的宫颈癌有关。,29,检验方法1 病毒分离鉴定 采取宫颈或阴道分泌物，接种到易感细胞中培养12天。出现细胞肿用胀，变圆，核融

17、合等病变，可作初步诊断。然后用免疫荧光法，酶联免疫吸附试验（ELISA）进行鉴定，确诊HSV感染。2 抗原检测 用IFA、ELISA等方法直接检测细胞内或分泌物中抗原，快速诊断HSV感染。3 抗体检测 检测病人血清中的抗体，可用于原发感染诊断，但不能与复发感染区别，因为人群HSV感染率高。4 DNA分子杂交法和PCR法检测,30,人巨细胞病毒（CMV）巨细胞病毒属疱疹病毒群 ，它只能在活细胞中生长，一般用人的纤维母细胞培养。被巨细胞病毒感染的细胞在光学显微镜下检查可见到细胞和核变大，有包涵体形成。核内包涵体周围与核膜间有一轮“晕”，因而称为“猫头鹰眼细胞”，这种细胞具有形态学诊断意义。检验方法

18、同HSV,31,人乳头瘤病毒（HPV）病毒分型 HPV是一组病毒的总称，组成一个科，其病毒形态类似，但DNA限制性内切酶图谱各异 。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型和高危险型，低危险型HPV包括HPV6、11、42、43、44等，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变（CIN I），高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变（CIN II/III）的发生相关，尤其是HPV16和18型。,32,人类免疫缺陷病毒(HIV) 艾滋病(AIDS)又称获得性免疫缺陷综合征，是由人类免

19、疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种免疫缺陷性疾病。检验方法1 抗体检测 酶联免疫吸附试验（ELISA）； 免疫荧光试验（IFA）； 颗粒凝集试验(PA) 斑点印迹试验(或免疫层析/或渗滤) 确证试验：蛋白免疫印迹法（WB）。 原理 用聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV蛋白进行分离，再将不同蛋白条带转移于硝酸纤维膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶标抗体染色，就能测出针对不同结构蛋白抗体，如抗gp120、gp41、P24抗体，特异性较高。,33,2 抗原检测用ELISA检测P24抗原,在HIV感染早期尚未出现抗体时,血中就有该抗原存在.由于P24量太少,阳性率通常较低。现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原，来提高敏感性。 3 核酸检测用PCR法检测HIV基因，具有快速、高效、敏感和特异等优点，目前该法已被应用于HIV感染早期诊断及艾滋病的研究中。 4 病毒分离常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA刺激并培养后，加入病人单个核细胞诊断及艾滋病的研究中。,34,阴道分泌物检查的质量控制熟练辨认有形成分；选择技术成熟、能满足临床需要的检验技术；3 注意药物的影响；3 统一操作；4 搞好质量控制。,