肿瘤免疫治疗新方法.doc

1、1自体细胞免疫疗法CIK（cytokine-induced killer，中文名：自体细胞免疫疗法多种细胞因子诱导的杀伤细胞）是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3 单克隆抗体、IL-2 和 IFN- 等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达 CD3+和 CD56+两种膜蛋白分子,故又被称为 NK 细胞样 T 淋巴细胞,兼具有 T 淋巴细胞强大的抗瘤活性和 NK 细胞的非 MHC 限制性杀瘤优点。因此,应用 CIK 细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK 细胞中的效应细胞 CD3+和 CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅 1%5%

2、。1CIK 特点CIK 细胞中的效应细胞 CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅 1%5%，在体外经多因子培养 2830 天，CD3+CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可达 1000 倍以上。实验证明，扩增出的 CD3+CD56+细胞来源于 CD3+CD56-T 细胞，而非 CD3-CD56+NK 细胞。同时发现在 CD3+CD56-的 T 细胞中，除CD4-CD8-T 细胞外，其余三种 T 细胞亚群（CD4-CD8+、CD4-2CD8-、CD4+CD8+）均可通过体外多因子培养而获得 CD56 分子的表达，而由于 CD4+CD8+细胞和 CD4-CD8-细胞在正常人外周血中含量

3、极低而间接提示此 CD3+CD56+细胞绝大多数来源于外周血中 CD4-CD8+T 细胞。而由于 CD4-CD8-T 细胞在培养 1 个月后有近 56%的 T 细胞同时表达 CD56 和 CD3，表明其也是 CIK 细胞的重要来源。比较 CD3+CD56+CIK 细胞中表达 CD8+和 CD8-,的两群细胞其杀瘤活性没有显著性差异，提示 CIK 细胞的细胞毒性与CD3CD56 表达成相关趋势，而与 CD8 的表达未表现出相关性。杀伤原理CIK 细胞能够通过三种途径杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞：CIK 细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的直接杀伤：CIK 细胞可以通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/

4、穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞裂解。CIK 细胞释放的大量炎性细胞因子具有抑瘤杀瘤活性：体外培养的 CIK 细胞可以分泌多种细胞因子，如 IFN-、TNF-、IL-2 等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。CIK 细胞能够诱导肿瘤细胞的凋亡：CIK 细胞在培养过程中表达 FasL（型跨膜糖蛋白）通过与肿瘤细胞膜表达的Fas（型跨膜糖蛋白）结合，诱导肿瘤细胞凋亡。3CIK 细胞发挥作用的三种途径杀瘤特点应用 LAK 细胞是目前较为普及的肿瘤过继免疫治疗方案，广泛使用于黑色素瘤、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和结肠癌。因 LAK 细胞扩增数量有限，杀瘤活

5、性也较 TIL 等 T 淋巴细胞为低，故虽然杀瘤谱广，但效果局限。相比较而言，TIL 细胞本身较 LAK 细胞具有更强大的抗瘤效力，但由于杀瘤谱窄，制备困难，及在收集过程中可能导致的功能改变而限制了其临床应用价值。与上述两种效应细胞过继免疫治疗相比，CIK 细胞具有独特的优势，列举如下。1. 增殖速度快CIK 细胞在培养过程中加入 IFN-、IL-1、抗CD3、McAb、IL-2 等多因子后，细胞增殖速度迅速加快，远超过 LAK 细胞。在培养第 22 天增殖曲线达顶峰，约增加 100 倍，其中 CD3+CD56+细胞不仅绝对数量增加 1000 倍以上，且所占百分比也大幅上升，培养至 2830

6、天时达平台期，细胞毒活性亦达峰值，而 LAK 细胞培养前后数量没有明显增加。2. 杀瘤活性高CIK 细胞是以 CD3+CD56+T 细胞为主的异质细胞群，大量体内外实验证实 CIK 细胞较以 NK 细胞为主的 LAK 细胞具4备更强大的杀瘤活性，而且其体内杀瘤细胞毒性的维持不必依赖大剂量外源性 IL-2 的持续给予。体外实验中，任欢和 Lu 等均发现在体外等数量的 CIK 细胞比 LAK 细胞对肿瘤细胞系的杀伤能力稍高或相近，但因 CIK 细胞在培养过程中 CD3+CD56+效应细胞增长迅速，故 CIK 细胞的总杀伤单位（TLU）为 LAK 细胞的 73 倍甚至更高，其杀伤效率显著高于 LAK

7、 细胞。肿瘤克隆抑制实验显示，CIK 细胞的瘤细胞抑制 Log 指数为 2.53.5，较 LAK 细胞的瘤细胞抑制指数高 2 个 Log。体内实验发现，对于在严重联合免疫缺陷小鼠身上构建的人类 B 细胞淋巴瘤 SU-DHL4 模型，CIK 细胞在清除荷瘤鼠体内肿瘤病灶，抑制转移，延长生存期等方面的作用均明显优于 LAK 细胞。3. 杀瘤谱广CIK 细胞虽然以 CD3+CD56+ T 细胞为主要效应细胞，但却没有T 淋巴细胞杀伤时的 MHC 限制性，故对于多种肿瘤细胞系（包括 NK 敏感的 K562 和 NK 不敏感的 Hela、HL60、人 T 细胞急淋白血病细胞系 OCRF-CEM，人淋巴瘤

8、细胞系 OCI-LY8、LAM53，人结肠癌细胞系 HT-29、CR75，人肾癌细胞系 A704）和新鲜肿瘤组织均表现出强大的杀伤活性。4. 对多重耐药肿瘤细胞同样敏感5Wolf 用阿霉素和长春新碱诱导出多重耐药细胞系 K562/DOX 和CCRF-CEM-VBL，发现 CIK 细胞对化疗药物敏感的亲本细胞和不敏感的转化细胞均具有强大的杀伤活性，两者比较无差别。5. 杀瘤活性不受 CsA、FK506 等免疫抑制剂的影响Mehta 观察到免疫抑制剂 CsA 和 FK506 虽然可以抑制抗 CD3 单抗介导的 CIK 细胞脱颗粒过程，却不影响靶细胞诱导的 CIK 细胞脱颗粒，并且 CIK 细胞对靶

9、细胞的杀伤活性不会因此降低。6. 对正常骨髓造血前体细胞毒性很小Seheffold 通过 CFU-GM 形成实验检测 CIK 细胞对骨髓造血前体细胞的影响，发现 CIK 细胞对 K562 细胞的杀伤强度高达 3 级，但对 GM-CFU 仅有不足 1 级的抑制。Holye 也证实 CIK 细胞对正常髓系克隆生成几乎没有影响，只是对红系的生成显示出轻度抑制，这可能与 CIK 细胞自身分泌较高水平的 IFN- 有关。7. 能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞 Fas-FasL 凋亡已证明过继免疫治疗失败的一个重要原因是过继效应细胞被肿瘤细胞表面表达的某些蛋白（主要是 FasL）诱导凋亡，而 CIK细胞虽然在

10、 Fas 被占据后会引起少量细胞凋亡，但对其杀瘤细胞毒性没有明显影响。Verneris 的实验提示 CIK 细胞内有抗凋亡基因表达，并检出多种保护基因，如 cFLIP、Bcl-2、Bcl-6X1、DAD1 和 survivin 的转录水平上调。同时发现 CIK 细胞具备合成 FasL 的能力，CIK 细胞培养上清中可以检测到具生物学活性的水溶性 FasL，表明 CIK 细胞可以对抗体内 FasL 阳性肿瘤所引发的效应细胞活性下降甚至消失。影响杀伤活性的因素1.外源性细胞因子的补充CIK 细胞的体外扩增需要外源性细胞因子，如 IL-2、IL-7、IL-12 等的辅助，这些因子控制着人免疫系统内各

11、种抗原特异性细胞的扩增及其生物学活性。外源性 IL-2、IL-7、IL-12可以显著促进淋巴细胞的生长，尤其存在有 IL-2 和 IL-7 条件下 CIK 细胞的增殖率为高，而外源性, IL-2、IL-7、IL-12 对CIK 细胞的细胞毒活性没有影响。外源性 IL-2 和 IL-7 的刺激会降低 CIK 细胞表面相应受体的表达量，而 CD28 分子在 IL-7存在条件下较 IL-2 时表达更高。IL-12 会降低 CIK 细胞表面ICAM-1 的表达，IL-7 则会提高 CD56 的表达。与 IL-2 相比，IL-7 可明显增加 CD4+细胞的比例。虽然外源性 IL-2、IL-7 和IL-1

12、2 培养过程中均可出现少量凋亡细胞，但有研究显示外源性 IL-12 的添加会增加 CIK 细胞中坏死细胞的比例。抗 CD3McAb 不仅在 CIK 细胞培养过程中起着重要作用，在提高CIK 细胞对白血病及淋巴瘤的杀伤敏感性上同样具有促进作用。Lefterov 将抗 CD3McAb 与靶细胞预先共同孵育可增加 CIK 细胞7对其的杀伤敏感性，而且这种增强作用可以被抗 FcR 的抗体（如抗 CD36、抗 CD32）所部分阻断，间接证明抗 CD3McAb 引发的杀伤活性增高与 FcR 介导的抗体结合有关。2.多种细胞因子基因的转染由于 CIK 细胞扩增对外源性细胞因子有依赖，因此通过基因转移方法将相

13、关基因转入 CIK 细胞，不仅可减少外源性细胞因子的使用量，还可提高 CIK 细胞自身的抗瘤活性。IL-7：Fitke 利用改进的腺病毒转基因系统将人 IL-7 基因转染 CIK 细胞，发现转染后细胞可以生成较高浓度 IL-7，最多者可达 1 100pg/106cell/24h。合成的 IL-7 具有明显的生物学活性，可以促进转染 CIK 细胞的增殖，显著高于未转染细胞。外源 IL-7 基因的表达同时改变了 CIK 细胞对其他细胞因子的分泌，其中尤以 TNF- 分泌显著升高，这一现象在未转染 CIK 体外添加 IL-7 时并未观测到。虽然转染后 CIK 细胞表面各种与细胞杀伤活性相关的表面抗原

14、，如 ICAM-1 等与未转染 CIK 细胞相比无明显变化，但转染后 CIK 细胞在对多种肿瘤细胞系如肾癌、恶性黑色素瘤以及结肠癌的杀伤能力较未转染 CIK 细胞有明显增强。IL-2：Lu 等发现 CIK 细胞培养过程中 CD56 分子的表达是 IL-2依赖性的，但单独 IL-2 的存在却会降低培养后 CIK 细胞的表型变化幅度。尽管有实验指出 CIK 细胞的体内治疗并不需要 IL-28体外持续供给，但 Zoll 等的研究结果表明，体外培养中 IL-2对 CIK 细胞的增殖和杀伤功能有促进作用。Schmidt-Wolf 将包含人 IL-2 基因片段的重组质粒用电穿孔法导入 CIK 细胞治疗转移

15、性实体瘤，发现转染后细胞可分泌较高水平的 IL-2（330-1 800pg/106 cell/24h，平均达 836pg/106 cell/24h ）。虽然转染前后 CIK 细胞表面各种膜蛋白表达并无显著变化，但体外检测转染后 CIK 细胞在增殖率和细胞杀伤活性上均高于未转染细胞。制备流程CIK 细胞制备流程抽取患者的外周血，在 37，5%的二氧化碳培养箱中孵育2h，使用高速离心机分离，收集悬浮细胞，在体外（模拟人体内环境），加入多种细胞因子如 CD3 单抗，IFN-R，IL-2 等培养，每隔 2-3 天换一次培养液，第 7、11、13、15 天收集 CIK细胞，CD3+和 CD56+细胞迅速

16、增多，较培养前升幅可达 1000 倍以上。发展历程1985 年美国外科医生首次发现大剂量的 IL-2 在体外可以将淋巴细胞培养成具有很强肿瘤杀伤作用的细胞，称为 LAK 细胞。以后发现在培养液中加入 CD3 单克隆抗体可以将这些细胞的肿瘤杀伤活性提高十几倍，扩增的数量也大幅提高，这种细9胞称为 CD3AK。在这个基础上再在培养液中加入 INF-r、IL-1等细胞因子,得到表达 CD3CD8CD56 阳性的异质细胞群，这些细胞称为 CIK，相比 LAK 细胞增殖倍数更多，杀毒活力更强。 1991 年美国斯坦福大学 Schmidt Wolf 等人首次报道了 CIK 细胞。国内临床应用情况和相关政策

17、法规早在 1996 年国内已有 CIK 细胞治疗技术临床应用的研究论文发表，目前国内已有超过百家的医疗单位开展了该项治疗技术的相关临床应用与研究。根据国际国内细胞治疗临床应用的进展状况，2009 年 5 月 1日卫生部颁发执行的医疗技术临床管理应用办法将“自体免疫细胞治疗技术”列为三类医疗技术。2适应症CIK 细胞治疗属于过继细胞免疫疗法，由于 CIK 细胞溶瘤作用是非 MHC 限制性的，即不受肿瘤组织类型的限制，因此对任何一种肿瘤均有杀伤作用，但对高抗原表达的癌症疗效最好，如：髓性白血病、黑色素瘤、肾细胞癌、转移性肾癌、非何杰金氏淋巴瘤等。其它癌症如肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、大肠癌等

18、，CIK 细胞治疗亦有较好的疗效。CIK 细胞治疗适用于任何一期的癌症患者，但对早期肿瘤患者或经过手术及放化疗后肿瘤负荷较小的患者效果好。它对于手术、放化疗或造10血干细胞移植后患者体内微小残留病灶的清除，防止癌细胞扩散和复发，提高患者自身免疫力，减少毒性反应等方面具有重要作用。某些不适合手术、不能耐受放化疗的中晚期肿瘤患者，CIK 细胞治疗可以提高其生活质量，延长带瘤生存时间。特点1.CIK 细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，且细胞活性也大大增强。2.CIK 细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用。3.杀瘤谱广，可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌等多种肿瘤的治疗，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感。4.是典型的个性化生物治疗模式。将这类细胞回输后，还能使机体免疫能力提高，产生特异的抗病毒作用，从而对肿瘤治疗施以双重的作用。5.由于 CIK 细胞是活化的自体细胞，用起来非常安全。有效期CIK 细胞通过直接杀伤、分泌多种细胞因子等直接抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡起到治疗作用。大多数执行杀伤功能的细胞在回输后立即执行其功能，半衰期约 2 周至一个月。回输的细胞中包括一部分记忆细胞，可存活几年至几十年，当遇到相应刺激后，迅速在体内活化，杀伤靶细胞。所以 CIK