胆红素的提取与精制.doc

1、胆红素的提取精制与应用摘要：胆红索是制药工业的贵重原料，可人工工合成牛黄，合成牛黄的胆红索要求质量较高，因此探索胆红素的提取方法，具有重要的科学价值和经济利益。改进备胆红索钙盐、酸化、精制等阶段，使胆红索产率和纯度都有明显提高。关键词：胆红素 、精制 、探索 、临床应用正文：一、概述 胆红素是人造牛黄的贵重原料，价格昂贵曾达 25 万元/kg，现在市场价 5 6 万元/ kg，天然牛黄中的胆红素的含量高达 50%60%。天然牛黄中的胆红素钙盐是胆汁生石的重要原因。据北大吴瑾光教授的研究发现人胆石中的胆红素是和糖蛋白、多糖结合存在的；有少量的胆红素用强酸、强碱处理也不被破坏，游离胆红素在血中浓度

2、过高显示毒性结合胆红素是无毒的。据药理实验证 明，游离胆红素对乙型脑炎病毒的灭活率抑制指数是去氧胆酸和胆酸的 1.0 1.5 倍。据 日本岗奇公彦报告，胆红素被氧化成胆绿素，成为一种有效的肝脏治疗药，他在不破坏肝组织的情况。有增殖新细胞的作用，可用于血清肝炎、肝硬变的治疗。胆红素对 W256 瘤有较好的抑制作用。另外，胆红索还有解热、降压、促进红血球新生等作用。我国对胆红素的需求量很大，人造牛黄已超过100t 因此，胆红素提纯方法的探索有重要经济价值。 胆红素的研制开始于 1864 年，staedeler 首先从胆石中分离了胆红素。1955 年我国天津育发制药厂郭巩等人从牛胆汁中提取出胆红素；

3、1960 年武汉肉联厂开始用钙盐法从猪胆汁中提取胆红素。20 世纪 60 年代末北京同仁堂中药提炼厂郑谷栋教授对提炼方法进行了改进；1988 年先后有人提出“ 快速提取胆红素新技术” ， “ 自提胆红素技术” 等等。胆红素的提取归纳起来主要有两条途径 ：（1）先用乙醚、乙醇提取后的胆汁剩余物。再用三氯甲烷提取胆红素；（2）先制备胆红素钙盐，盐酸酸化，三氯甲烷提取。 第（1）种途径直接用氯仿提取，收得率低，只能达到 0.0164 0.0168。因为胆汁中的胆红素是种极易溶于水的胆红素结合物结合胆红素，所以直接氯仿提取不尽合理第（2）种途径为胆红素钙盐法，其收得率可增加 1 2 倍 ， 但生产周期

4、长，相应成本提高。 二、胆红素提取方法的探索 我们对第（2）种方法进行了反复探索，并作了一些改进，使胆红素的产率和质量明显提高。 1、制备胆红素钙盐 取新鲜胆汁，80 目过滤，加入 4 倍澄清石灰水，充分搅拌均匀，然后在搅拌下逐渐加温， 温度升到 50 C，停止搅拌，55 t 到 60 C 捞去白沫，65 停止捞，继续升温至 9 5 ， 捞取胆红素钙盐( 拮红色)。这和传统方法直接加热至沸腾捞取胆红素钙盐有明显不同。 （1）石灰水的制备 1 份生石灰和 3O 份清水，搅拌均匀，密闭保存 2 4 h 以上。（2）石灰水的用量取胆汁 4 4.5 倍的澄清饱和石灰水为宜。若石灰水量不足，胆红素钙盐不

5、呈红色，若胆红素钙盐颜色很淡，说明钙盐浓度很低，或胆汁已变质。 （3）制备温度升温要缓慢，搅拌必须在 55 前停止，若继续搅拌钙盐损失加大，温度不能至沸 ，100C 时上下翻滚， 使钙盐和胆汁酸混合机会增多。 2、胆 红 素的抽提酸化 常规用盐酸酸化，易结成十分牯稠的团块，使胆汁酸将胆红素裹住致使后序提取工作难度加大。且天然胆红素 I x a 在浓盐酸中发生异构，形成 23 的胆红素a 和 29 的胆红素 xa ，若改用醋酸只能形成 3 的胆红素a 和 4 的胆红素 xa 。此外， 醋酸对氧化剂稳定，井可溶解胆汁，使团块分散，易提取。 3、回收精制 （1）蒸馏水温度严格控制在 80 到 85

6、，超过 85 部分胆红素热解，回收率大大下降。（2）乙醇的加入时间至关重要，传统方法不注意此。乙醇加入过早，使 乙醇和氯仿混溶，胆红素不易结晶；乙醇加入慢丁，胆红素部分热解。根据实践，无水乙醇的加入时机要掌握 3 个要领： 观色， 呈桔红色时；观气，基本无翻滚气泡；闻味，基本无氯仿味。三、生产工艺 1、工艺路线 猪胆（破碎）胆汁（煮沸制钙盐）胆钙盐（20C 条件下酸化）酸化物（20C 条件下二次酸化）沉淀（热水洗）沉淀（氯仿提取）提取液（蒸馏）胆红素（乙醇洗涤）成品胆红素2、工艺过程 （1）钙盐的制备。取新鲜胆汁 1kg，加入 4 4.5 倍澄清饱和石灰水，搅拌均匀，加热至 95 。捞取液面橙

7、红色胆钙盐,井趁热压干。 （2）酸化于钙盐中加入适量蒸馏水，捣成糊状，过 60 目筛，加入 1 %的 Na H S O3。在搅拌下加入 HAc 调 pH 一 12，静置 30s，过滤得沉淀。 （3）乙醇处理。沉淀中加入适量 95%的乙醇，捣成棚状，再加入 3 0 0 4 0 0mL 95%乙醇和 0.5%的 NaHSO3，搅拌均匀，使 p H=3 3.5 。静置，虹吸祛除乙醇( 可回收)，下层加入适量 405 O 温水，静置分层，虹吸祛除下层废水。 （4）提取于收集物中加入氯仿 400 mL，回流提取或不断搅拌抽提，然后在分液器分层，收集下层氯仿层，于常压下蒸发出氯仿(水搭温度小于 85)，于

8、残留物中加入适量无水乙醇，继续蒸馏直至无氯仿味，趁热过滤，抽干，真空干燥得成品。（5）产率。第（1）种方法产率在 0.0164%0.0168%，平均 3035 个猪胆产1 g ，方法改进后的产率 在 0.0230%0.0235，平均 2325 个猪胆产 1g 。 （6）胆红素纯度。采用摩尔吸收系数法。精密称取胆红索样品 10 mg，用 AR级氯仿少许研磨溶解，移入 100 mL 量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，精密量取氯仿溶液 5ml 置 50mL 计量瓶中。再用氯仿稀释至刻度，摇匀，于波长 450n m 处浏 OD 值。 w( 胆红索) =( OD104.03)/100 = 0.8750(平均)

9、 104.03/100 =91.03%4、胆红素临床上的应用应用近来的研究表明，胆红素在人体内具有抗氧化作用，能清除自由基，抑制脂类和脂蛋白过氧化，改变某些酶的活性，阻断 DNA 分子，减轻氧化损伤，它与人体内其它抗氧化防御系统（GSH、SOD、VITE）具有协同作用。大量研究发现胆红素具有明显抑制低密度脂蛋白的氧化修饰作用，减缓对血管内皮的损伤，抑制血栓和泡沫细胞的生成，从而防止和降低动脉粥样硬化的发生，胆红素除本身的抗氧化作用外，胆红素还能通过抑制蛋白激酶 C 发挥细胞保护作用。在一定条件下，胆红素会生成一种被称为肝脏生长因子（LGF）的白蛋白-胆红素复合物，其对肝细胞有再生作用，Ossl

10、oa 等通过实验证明，胆红素能明显抑制肝脏内脂质过氧化物的增高，阻止抗氧化酶的降低。因此，胆红素在人体内不仅是一种有害毒素，还是一种内源性抗氧化剂，它在体内主要通过清除过氧化脂质，切断过氧化脂质引起的连锁反应，防止细胞破坏，另外胆红素还能直接清除氧自由基，于早期阶段终止自由基引起的细胞损害，对心、脑、肝脏和血管等多种组织与器官具有重要的生理保护作用。由于胆红素在体内具有伤害与保护的双重作用，这对我们检验工作者就提出了新的标准，要求我们采用最佳方法，准确定量分析胆红素的高低值，及时反馈给临床最新信息。近一个世纪来，临床一直把血中高胆红素浓度作为判断肝胆疾病的重要指标。自从1994年Schwert

11、ner等发现低胆红素浓度可能是冠心病的新的危险因子以来，许多学者作了大量有关胆红素的研究，并随着胆红素检测方法的特异性、准确性的提高，胆红素与临床疾病的关系越来越受到临床的重视。胆红素与冠心病 近年研究表明，胆红素具有抗氧化作用，体外实验证明，其抗氧化性甚至超过维生素 C、维生素 E 等。越来越多的研究表明，低浓度胆红素可能是冠心病新的危险因子，Schwertner 等通过研究指出，冠状动脉疾病患者由于体内氧化活性的提高，使胆红素的消耗量增加，从而导致体内胆红素浓度降低，此发现在后来的缺血性心脏病的研究中得到了证实。另外吸烟会降低胆红素的浓度，增加脂蛋白的浓度，从而增加患冠心病的机率。Hule

12、a 等报道，血清中生理浓度下的直接和间接胆红素能有效地抑制金属离子（如 Cu2+ Fe2+）催化的低密度脂蛋白修饰反应，而胆红素的这种抗低密度脂蛋白氧化修饰正是其防止动脉粥样硬化和降低冠心病危险性的主要机制所在。有研究发现，当胆红素浓度下降 50%，发生动脉病变的危险性就增加 47%。另有报道，冠心病患者体内胆红素浓度不一定持续低于正常对照者，当冠心病急性心肌梗死时其血清胆红素浓度不但不降低反而可能会升高，因为此时伴随着血红蛋白、肌红蛋白分解或心功能不全而引起胆红素浓度升高。 胆红素与脑血管疾病 脑出血是常见的脑血管疾病，脑出血后大量红细胞破坏，破坏的红细胞释放出血红蛋白，并很快生成胆红素，那

13、么脑出血后血清胆红素浓度升高是否是由于颅脑内红细胞破坏释放出血红蛋白而导致血清胆红素浓度增高？Dohi 等认为脑出血和蛛网膜下腔出血后早期血清胆红素浓度显著升高，说明氧化应激存在，可认为是机体对疾病的一种保护性反应，并认为血清胆红素浓度可以作为出血性中风后一个有用的氧化应激指标。Yaot 等在研究精神分裂症病人时发现，患者体内胆红素浓度比正常人偏低，而且这种症状与患者的年龄有一定的关系，因此他们认为，患者体内胆红素浓度的下降，可能使细胞遭受了某种损伤，从而使机体免疫系统发生了改变。仲过生等认为血清胆红素浓度的下降可能是血管性痴呆病的又一个危险因素。魏瑞理等通过研究认为，脑梗死急性期（3d 内）

14、患者与脑出血急性期患者血清胆红素水平较正常对照组偏高，但两组之间差异无显著性，说明脑出血体内胆红素水平的升高主要不是颅内血肿分解代谢的结果，可能与脑梗死一样有着另外的原因。胆红素与胆结石 Liu 等通过动力学研究证明，胆红素生成的自由基是胆石症形成的关键因素。胆红素生成的稳定自由基经血循环在胃肠道造成细胞损伤，这种自由基造成的细胞损伤可引起粘蛋白分泌，而在粘蛋白存在下，胆红素钙沉淀颗粒变大，这被认为是形成胆结石的关键因素之一。胆红素与其些特殊疾病 1996年Yamaguchi等利用单克隆抗体法首先检测到了阿尔茨海默病（AD）患者大脑中极微小量的胆红素含量，从而为人们研究胆红素与AD之间架起了桥

15、梁。胆红素还在发现、诊断某些遗传性疾病方面发挥着重要的作用，如先天性非溶血性黄疸（Gilbert综合征、Grigler-Najjar综合征、Dubin-Johnson综合征） ，家族性肝内胆汁郁滞黄疸（Byler病） ，它们的一个共同特点就是体内胆红素水平较正常人偏高，轻者常小于85mol/L以下，重者可达500mol/L以上，因此胆红素的检测对遗传疾病的早期发现、早期诊断以及病情预后具有重要的意义。5、总结与讨论 （1）在胆红素的提取过程中，胆红素钙盐的制备要采用优质生石灰。 （2）酸化浸提过程不宜过长，特别是加入乙醇后的氯仿溶液，困乙醇可破坏胆红素分子内氢键而影响产率，若放置 24h 上，

16、产率下降 1 个百分点。 (3)胆红素遇三价 Fe 离子可被氧化还原，操作过程避免使用铁制品及铁容器。 （4）蒸增过程避免强光照射，免胆红素分解。 （5）胆红素为橙色至暗红棕色粉末或结晶，加热易变黑，常出现胆红素颜色变深。影响产品质量。参考文献： 1 吴瑾光.人胆石中的胆红素 J 北京大学学报， 1 9 8 0 ， 6 ( 1 ) ： 3 3 -3 4 2 张能荣胆红素生产方法的研究 D 生亿药物杂志， 1 9 8 4 ， 2 ( i ) ： 3 13 8 3 何兆雄动物生化制药基础 M 北京： 中国商业出版社， 1 9 8 5 3 3 3 -3 3 5 4 刘荣建. 胆红素提取方法新探索.河北师范大学学报， 2002 第 26 卷第一期.