分子生物学课件重点整理 朱玉贤.doc

1、1第二章 染色体与 DNA染色体（chromosome）是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质(chromatin)的形式存在的。染色质是一种纤维状结构，叫做染色质丝，它是由最基本的单位核小体(nucleosome)成串排列而成的。原核生物(prokaryote) ：DNA 形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。染色体由 DNA 和蛋白质组成。蛋白质由非组蛋白和组蛋白（H1,H2A,H2B,H3,H4）DNA 和组蛋白构成核小体。组蛋白的一般特性：P24进化上的保守性无组织特异性肽链氨基酸分布的

2、不对称性：碱性氨基酸集中分布在 N 端的半条链上。组蛋白的可修饰性:甲基化、乙基化、磷酸化及 ADP 核糖基化等。 H5 组蛋白的特殊性：富含赖氨酸（24%）(鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含 H1 而带有 H5)组蛋白的可修饰性在细胞周期特定时间可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和 ADP 核糖基化等。H3、H4 修饰作用较普遍，H2B 有乙酰化作用、H1 有磷酸化作用。所有这些修饰作用都有一个共同的特点，即降低组蛋白所携带的正电荷。这些组蛋白修饰的意义：一是改变染色体的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生改变，使其他调控蛋白易于和染色质相互接触，从而间接影响转录活性。2、DNA1) DN

3、A 的变性和复性变性（Denaturation) DNA 双链的氢键断裂，最后完全变成单链的过程称为变性。增色效应(Hyperchromatic effect)在变性过程中，260nm 紫外线吸收值先缓慢上升，当达到某一温度时骤然上升，称为增色效应。融解温度（Melting temperature ，Tm ) 变性过程紫外线吸收值增加的中点称为融解温度。 生理条件下为 85-95影响因素：G+C 含量，pH 值，离子强度，尿素，甲酰胺等复性（Renaturation)热变性的 DNA 缓慢冷却，单链恢复成双链。 减色效应（Hypochromatic effect) 随着 DNA 的复性，260

4、nm 紫外线吸收值降低的现象。 2) C 值反常现象（C-value paradox) C 值是一种生物的单倍体基因组 DNA 的总量。真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能 DNA 序列大多被不编码蛋白质的非功能 DNA 所隔开，这就是著名的“C 值反常现象”。 （四）核小体(nucleosome)：用于包装染色质的结构单位，是由 DNA 链缠绕一个组2蛋白核（H2A、H2B、H3、H4)*2 的八聚体】构成的。 1、原核生物基因组结构特点 基因组很小，大多只有一条染色体 结构简炼 存在转录单元(trnascriptional operon)多顺反子(polycistron

5、)重叠基因由基因内基因、部分重叠基因、一个碱基重叠组成。2、真核生物基因组结构特点真核基因组结构庞大 3109bp、染色质、核膜单顺反子基因不连续性 断裂基因（interrupted gene ） 、内含子(intron)、 外显子(exon)非编码区较多 多于编码序列(9:1) 含有大量重复序列 不重复序列/单一序列：在基因组中有一个或几个拷贝。真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。如：蛋清蛋白、血红蛋白等 功能：主要是编码蛋白质。 中度重复序列：在基因组中的拷贝数为 101104。如：rRNA 、tRNA一般是不编码蛋白质的序列，在调控基因表达中起重要作用 高度重复序列：拷贝数达到几

6、百个到几百万个。卫星 DNA：A T 含量很高的简单高度重复序列。1、 DNA 的一级结构：指 4 种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序， DNA 序列是这一概念的简称。碱基序列2）特征：双链反向平行配对而成脱氧核糖和磷酸交替连接，构成 DNA 骨架，碱基排在内侧内侧碱基通过氢键互补形成碱基对（A：T，C ：G ） 。2、DNA 的二级结构：指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。2）分类：右手螺旋：A-DNA ，B-DNA左手螺旋：Z-DNA3、DNA 的高级结构：指 DNA 双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。是一种比双螺旋更高层次的空间构象。2）主要形式：超螺旋结构（正超螺旋和负

7、超螺旋）（一）DNA 的半保留复制（semi-nservative replication）1、定义：由亲代 DNA 生成子代 DNA 时，每个新形成的子代 DNA 中，一条链来自亲代 DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。3、DNA 半保留复制的生物学意义：DNA 的半保留复制表明 DNA 在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。（二）与 DNA 复制有关的物质1、原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP)2、模板：以 DNA 的两条链为模板链，合成子代 DNA33、引物：DNA 的合成需要一段 RNA 链作为引物4、引物合成酶（

8、引发酶）：此酶以 DNA 为模板合成一段 RNA,这段 RNA 作为合成DNA 的引物（Primer)。实质是以 DNA 为模板的 RNA 聚合酶。5、 DNA 聚合酶: 以 DNA 为模板的 DNA 合成酶以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物反应需要有模板的指导反应需要有 3-OH 存在DNA 链的合成方向为 5 3 性质 聚合酶 聚合酶 聚合酶3 5 外切活性 + + +5 3 外切活性 + - -5 3聚合活性 + 中 + 很低 + 很高新生链合成 - - +聚合酶主要是对 DNA 损伤的修复；以及在 DNA 复制时切除 RNA 引物并填补其留下的空隙。聚合酶修复紫外光引起的 DNA 损伤聚合酶

9、 DNA 复制的主要聚合酶，还具有 35外切酶的校对功能，提高 DNA 复制的保真性6、DNA 连接酶（1967 年发现）：若双链 DNA 中一条链有切口，一端是 3-OH，另一端是 5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但是它不能将两条游离的 DNA 单链连接起来DNA 连接酶在 DNA 复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用7、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)：拓扑异构酶 ：使 DNA 一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的 蛋白拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链 DNA，作用是将

10、负超螺旋引入DNA 分子。同复制有关。例：大肠杆菌中的 DNA 旋转酶8、DNA 解螺旋酶 /解链酶（DNA helicase)：通过水解 ATP 获得能量来解开双链DNA。 E.coli 中的 rep 蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶 I、II、III。rep 蛋白沿 3 5移动，而解螺旋酶 I、II、III 沿 5 3移动。9、单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：稳定已被解开的 DNA 单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。（三）DNA 的复制过程（大肠杆菌为例） 双链的解开 RNA 引物的合成 DNA 链的延伸 切除 RNA 引物，填补缺

11、口，连接相邻的 DNA 片段1、双链的解开- ftju 制有特定的起始位点，叫做复制原点。 ori(或 o） 、富含A、T 的区段。4从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子复制时，解链酶等先将 DNA 的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉双链解开、复制起始 P44大约 20 个 DnaA 蛋白在 ATP 的作用下与 oriC 处的 4 个 9bp 保守序列相结合在 HU 蛋白和 ATP 的共同作用下,Dna 复制起始复合物使 3 个 13bp 直接重复序列变性,形成开链解链酶六体分别与单链 DNA 相结合(需 DnaC 帮助),进一步解开 DNA 双链2、

12、RNA 引物的合成DnaB 蛋白活化引物合成酶，引发 RNA 引物的合成。引物长度约为几个至 10 个核苷酸，3、DNA 链的延伸DNA 的半不连续复制（semi-discontinuous replication)：DNA 复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。在 DNA 复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA 链为滞后链。在 DNA 复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成 53 的多个短片段，这些不连续的小片段称为 冈崎片段 。

13、4、切除 RNA 引物，填补缺口，连接相邻的 DNA 片段（复制终止）当复制叉遇到约 22 个碱基的重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus 蛋白复合物能使DnaB 不再将 DNA 解链，阻挡复制叉继续前移。P47在 DNA 聚合酶催化下切除 RNA 引物；留下的空隙由 DNA 聚合酶催化合成一段 DNA 填补上；在 DNA 连接酶作用下，连接相邻的 DNA 链（四）复制的几种主要方式 P421、双链环状、 型复制、双向等速2、滚环型：（1）模板链和新合成的链分开;（2）不需 RNA 引物，在正链 3OH 上延伸（3）只有一个复制叉;3、D 环复制-单向复制的特殊方式如：动物线粒体 DNA

14、（五）真核生物中 DNA 的复制特点1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子（约 150bp 左右） ；2、复制叉移动的速度较慢（约 50bp秒） ，仅为原核生物的 110。3、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始 DNA 复制；真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。4、真核生物有多种 DNA 聚合酶。5、真核生物 DNA 复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。 （真核冈崎片段长约 100-200bp，原核冈崎片段长约 1000-2000bp。 ）（六）原核和真核生物 DNA 的复制特点比较5 复制起点（ori ）：原核一个，真核多个； 复制子 ：原核

15、一个，真核多个； 复制子长度：原核长；真核短； 复制叉：原核多个；真核多个； 复制移动速度：原核较快；真核较慢； 真核生物染色体在全部完成复制前，各起始点的 DNA 复制不能再开始。而在 快速生长的原核生物中，复制起点上可以连续开始新的 DNA 复制。 原核生物染色体的复制与细胞分裂同步，可以多次复制；真核生物染色体的复制发生在 S 期，是细胞分类的特定时期，而且仅此一次。四、DNA 的修复DNA 修复系统 功能错配修复 恢复错配碱基切除修复 切除突变的碱基核甘酸切除修复 修复被破坏的 DNADNA 直接修复SOS 系统修复嘧啶二体或甲基化DNADNA 的修复，导致变异1、错配修复 （mism

16、atch repair）Dam 甲基化酶使母链位于 5GATC 序列中腺甘酸甲基化甲基化紧随在 DNA 复制之后进行（几秒种后至几分钟内）根据复制叉上 DNA 甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基2、碱基切除修复 excision repair所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核苷酸位点的糖苷水解酶，它能特意切除受损核苷酸上的 N- -糖苷键，在 DNA 链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP 位点。一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺，然后改变配对性质，造成氨基转换突变* 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对* 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对* 胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对3、核苷酸切除修复

17、1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸3） DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链4）DNA 连接酶将切口补平4 、DNA 的直接修复在 DNA 光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和 6-4 光化物还原成为单体甲基转移酶使 O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止 G-T 配对SOS 反应 (SOS response)：是细胞 DNA 受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，6细胞为求生存而产生的 一种应急措施。* 包括诱导 DNA 损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。细胞癌变也与 SOS 反应有关。两个作用（1）DNA 的修复

18、；（2）产生变异五、 DNA 的转座DNA 的转座或叫移位（transposition)：由可移位因子(transposable element) 介导的遗传物质重排现象。转座子（transposon Tn）：存在于染色体 DNA 上可自主复制和位移的基本单位。已经发现“转座”这一命名并不十分准确，因为在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上，在新位点上出现的仅仅是它的拷贝。因此，转座有别于同源重组，它依赖于 DNA 复制。原核生物转座子的类型：1、插入序列(IS)IS 是最简单的转座子，不含有任何宿主基因，它们是细菌染色体或质粒 DNA 的正常组成部分。 2、复合转座子(comp

19、osite transposon)复合转座子是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的 IS 序列 3、TnA 家族 TnA 家族没有 IS 序列、体积庞大 (5000bp 以上)、带有 3 个基因，其中一个编码 -内酰胺酶(AmpR)，另两个则是转座作用所必须的。(三）转座作用的机制 转座时发生的插入作用的普遍特征，是受体分子中有一段很短的(3l2bp) 、被称为靶序列的 DNA 会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度是一样的，如 IS1 两翼总有 9 个碱基对的靶序列，而 Tn3 两端总有

20、 5bp 的靶序列。 靶序列的复制可能起源于特定内切酶所造成的黏性 DNA 末端。（三）转座作用的遗传学效应 p63（1）转座引起插入突变（2）转座产生新的基因（3）转座产生的染色体畸变（4）转座引起的 生物进化反转录转座子（retrotransposon）：指通过 RNA 为中介，反转录成 DNA 后进行转座的可动元件。第三章 生物信息的传递（上） 从 DNA 到 RNA转录(transcription) ：生物体以 DNA 为模板合成 RNA 的过程 。参与转录的物质原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板:DNA酶: RNA 聚合酶其他蛋白质因子RNA 合成方向：5

21、 到 37转录的不对称性：在 RNA 的合成中，DNA 的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。与 mRNA 序列相同的那条 DNA 链称为编码链；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA 合成的 DNA 链称为模板链。DNA 分子上转录出 RNA 的区段，称为结构基因。转录单元（transcription unit）一段从启动子开始至终止子结束的 DNA 序列。二、参与转录起始的关键酶与元件（一） RNA 聚合酶原核生物 RNA 聚合酶（大肠杆菌为例）-全酶= 核心酶+ 因子亚基基因 相对分子量亚基数组分 功能 rpoA 36500 2 核心酶 核心酶组装，启动子识别 rpoB

22、 151000 1 核心酶 rpoC 155000 1 核心酶 和 共同形成RNA 合成的活性中心 ？ 11000（需查）1 核心酶 ？rpoD 70000 1 因子 存在多种 因子，用于识别不同的启动子真核细胞的三种 RNA 聚合酶特征比较酶 位置 转录产物 相对活性 对 -鹅膏蕈碱的敏感性RNA 聚合酶 核仁 rRNA 50-70%不敏感RNA 聚合酶 核质 hnRNA 20-40%敏感RNA 聚合酶 核质 tRNA 约 10%存在物种特异性RNA 聚合酶与 DNA 聚合酶的区别RNA 聚合酶 DNA 聚合酶大小(M) 大，4.8105dol 小，1.09105dol引物 无 有产物 较短

23、，游离 较长，与模板以氢键相连8作用方式 一条链的某一段 两条链同时进行外切酶活性 无 5 3，3 5校对合成能力无 有修复能力 无 有（二） 启动子(promoter)启动子定义：指能被 RNA 聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA 序列。 TATA 区：酶的紧密 结合 位点（富含 AT 碱基，利于双链打开） TTGACA 区：提供了 RNA 聚合酶全酶 识别 的信号 转录起点-与新生 RNA 链第一个核甘酸相对应 DNA 链上的碱基。真核生物启动子的结构核心启动子（core promoter）定义：指保证 RNA 聚合酶转录正常起始所必需的、最少的 DNA 序列，包括转录起始位点及

24、转录起始位点上游 TATA 区作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始2、上游启动子元件包括 CAAT 盒（CCAAT）和 GC 盒（GGGCGG）等作用：控制转录起始频率。（三） 转录起始复合物-二元闭合复合物、二元开链复合物、三元复合物。 （原核）三、转录的基本过程1、起始位点的识别：RNA 聚合酶与启动子 DNA 双链相互作用并与之相结合的过程。RNA 聚合酶全酶( 2)与模板结合 2、转录起始RNA 聚合酶全酶( 2)与模板结合 DNA 双链解开 在 RNA 聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi

25、转录起始复合物: RNApol ( 2) - DNA - pppGpN- OH 33、RNA 链的延伸 亚基脱落，RNA pol 聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着 DNA 模板前移；在核心酶作用下，NTP 不断聚合，RNA 链不断延长。注意：9 个核苷酸以前还在启动子区，容易脱落，一旦形成 9 个以上的核苷酸并离开启动子区，转录正式进入眼神阶段。4、转录终止终止子（terminator）：位于基因的末端，在转录终止点之前有一段回文序列（反向重复序列）约 6-20bp。 真核生物终止: 由一段特定序列 5AATAAA 3和9回文序列（反向重复序列）组成。 分为两类：强终止子内部终止子：不依

26、赖 Rho ( )因子的终止。弱终止子 需要 因子（rho factor） ，又称为 依赖性终止子（ Rho-dependent terminator）不依赖 因子的终止当 RNA 链延伸到转录终止位点时，RNA 聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA 杂合物分离，转录泡瓦解，DNA 恢复成双链状态，而 RNA 聚合酶和 RNA 链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。终止位点上游一般存在一个富含 GC 碱基的二重对称区，RNA 形成发夹结构；在终止位点前面有一段由 4-8 个 A 组成的序列，RNA 的 3端为寡聚 U发夹式结构和寡聚 U 的共同作用使 RNA 从三元复合物中解离出来

27、。依赖 因子的终止 因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生 RNA 链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。（二） 、真核生物的转录过程1. 转录起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol 不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。（1）. 转录起始前的上游区段 顺式作用元件(cis-acting element)：影响自身基因表达活性的非编码 DNA 序列。例： 启动子、增强子、弱化子等 增强子：在启动区存在的能增强或促进转录的起始的 DNA 序列。但不是启动子的一部分。特点：1.远距离效应；2.无方向性；3.顺式调节；4.无物种和基因的特异性；5.

28、具有组织特异性；6.有相位性；7.有的增强子可以对外部信号产生反应。（2）. 转录因子：能直接、间接辨认和结合转录上游区段 DNA 的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合 RNA 聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。 参与 RNA-pol转录的 TF -TFD、 TFA、TFB、TFF、TFE、TFH（3）转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC) 真核生物 RNA-pol 不与 DNA 分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。 （4

29、）模板理论(piecing theory) 一个真核生物基因的转录需要 3 至 5 个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性、有专一性的复合物，再与 RNA 聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。 2. 转录延伸真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同10步的现象。 RNA-pol 前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。 3. 转录终止 和转录后修饰密切相关。四、转录后加工5端加帽、3 端加尾、RNA 的剪接、RNA 的编辑1、在 5端加帽5端的一个核苷酸总是 7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp） 。mRNA5端的这种结

30、构称为帽子（cap） 。帽子结构功能：能被核糖体小亚基识别，促使 mRNA 和核糖体的结合；m7Gppp 结构能有效地封闭 mRNA 5末端，以保护 mRNA 免受 5核酸外切酶的降解，增强 mRNA 的稳定。2、3端加尾-多聚腺苷酸尾巴-AAUAAA ：准确切割。 。加 poly（A）多聚腺苷酸尾巴功能：提高了 mRNA 在细胞质中的稳定性。3、RNA 的剪接生物体内内含子的主要类型：U-AG、AU-AC、类内含子、类内含子类内含子参与 RNA 剪接的物质： snRNA（核内小分子 RNA） 、snRNP（与 snRNA 结合的核蛋白） 、核内 RNA（U1、U2、 U4、U5、U6 ）4、

31、RNA 的编辑* 编辑（editing）是指转录后的 RNA 在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。五、原核生物与真核生物 mRNA 的特征比较1、原核生物 mRNA 的特征 半衰期短 多以多顺反子的形式存在 单顺反子 mRNA：只编码一个蛋白质的 mRNA。多顺反子 mRNA：编码多个蛋白质的 mRNA。Z： -半乳糖苷酶 Y： 透过酶 A：乙酰基转移酶ZYA 为结构基因 5 端无“帽子”结构， 3 端没有或只有较短的 poly（A ）结构。 SD 序列：原核生物起始密码子 AUG 上游 7-12 个核苷酸处有一被称为 SD 序列的保守区。mRNA 中用于结合原核生物核糖体的序列。 P85 2、真核生物 mRNA 的特征“基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能 RNA 所必需的全部核甘酸序列。 5 端存在“帽子”结构