人脑源性神经因子BDNF酶联免疫分析ELISA.DOC

1、TEL:4001610125 Web: Catalog #:95193Hu 人脑源性神经因子 (BDNF)酶联免疫分析（ ELISA） 试剂盒使用说明书 96t 目 的： 本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中 人脑源性神经因子 (BDNF)的含量。 检测范围 ： 5.0ng/L -100ng/L 实验原理： 本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中 人脑源 性神经因子 (BDNF)水平。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入 人脑源性神经因子 (BDNF)，再与 HRP 标记的抗原结合，形成抗原 -抗体 -酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB

2、 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成最终的黄色。 颜色的深浅和样品中的 人脑源性神经因子 (BDNF)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值） ，通过标准曲线计算样品中 人脑源性神经因子 (BDNF)浓度。 试剂盒组成： Reagent Quantity 酶 标包被 板 12well8strips 标准 品 : 480pg/mL 10.5ml 标准品 稀释液 11.5ml 酶标试剂 16ml 样品 稀释液 16ml 显色剂 A 液 16ml 显色剂 B 液 16ml 终止液 16ml 30 倍浓缩洗涤液 120ml30flod 说明书 1 封板膜

3、2 密封袋 1 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分） 。 仔细 收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后， 离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分） 。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分） 。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 TEL:4001610125 Web:

4、Catalog #:95193Hu 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分） 。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（ PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分） 。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS， PH7.4。用液氮迅速冷冻保 存备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 PBS（ PH7.4） ，用

5、手工或匀 浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分） 。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能 马上进行试验，可将标本放于 -20保存，但应避免反复冻融 . 7. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP）活性。 操作步骤： 1. 标准品：其浓度为 1,00pg/mL(贮液 )。先将其稀释为 100pg/mL(标准曲线最高浓度 )后，再准备 5 个稀释标准品的 EP 管 ，每个 EP 管中加入 150 L 的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释

6、成 100pg/mL, 50pg/mL,25pg/mL, 12.5pg/mL, 6.25pg/mL, 3.12pg/mL,，标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液 Tube 0 1 2 3 4 5 pg/mL 1.00 50 25 12.5 6.25 3.12 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、待 测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40 l，然后再加待测样品 10 l（样品最终稀释度为 5 倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜

7、封板后置 37温育 30 分钟。 4. 配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去， 如此重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50 l，空白孔除外 。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50 l，再加入显色剂 B50 l，轻轻震荡混匀， 37避光显色 15 分钟 . 10. 终止：每孔加终止液 50 l，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。 11. 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的吸光度（ OD 值） 。 测定应 T

8、EL:4001610125 Web: Catalog #:95193Hu 在加终止液后 15 分钟以内进行。 注意事项： 1 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后 如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间 最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值） ，请先用样品稀释液稀释一定倍数

9、（ n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（ n 5） 。 5 封板膜只限一次性使用， 以避免交叉污染。 6 底物请避光保存。 7 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准 . 8 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9 本试剂不同批号组分不得混用。 计算： 以标准物的浓度为横坐标， OD 值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度 。 （此图仅供参考） 试剂盒性能： 1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990 以上。 2.批内与批见应分别小于 9%和 11% 3.保存条件及有效期： a.试剂盒保存： 2-8。 b.有效期： 6 个月