大熊猫核糖体蛋白L10亚基基因(RPL10)的cDNA.doc

1、大熊猫核糖体蛋白 L10 亚基基因( RPL10)的 cDNA 克隆及序列分析苏秀兰，侯怡玲，李俊，孙冰，吴光富，宋嫣，张田，侯万儒（637002 四川南充，西华师范大学生命科学学院）摘要 目的 了解大熊猫( Ailuropoda melanoleuca) 核糖体蛋白亚基 RPL10 基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPL10 基因的异同。 方法 根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白L10亚基基因(RPL10)的相关信息设计引物， 运用RT-PCR技术，从大熊猫的肌肉组织总 RNA 中对核糖体蛋白亚基RPL10 基因的进行克隆、测序；采用Genescan 软件，对所克隆

2、的基因序列进行氨基酸序列推定；采用ORF finder软件进行DNA 序列的开放阅读框( open reading frame ，ORF) 查找；采用DNAMAN Version 6软件，对基因序列和氨基酸序列进行同源性比较；采用Ex2PASy Proteomics Server 软件，进行蛋白质功能位点和生化特性预测分析； 采用http:/www.imtech.res.in/raghava/apssp2/对蛋白质二级结构进行模拟分析 结果 大熊猫RPL10 基因的表达序列长为685bp，开放阅读框(ORF)为645 bp，编码214个氨基酸的蛋白质，该蛋白的相对分子质量为24.5997 kD

3、a，等电点为10.74，含有4个功能位点，分别为：2个蛋白激酶C磷酸化位点，2个 N化位点，2个酰胺化位点，1个核糖体蛋白L10 signature位点。进一步分析发现，该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的人、牛、家犬、褐家鼠、小家鼠有很高的相似性，其表达序列同源性分别为92.4%，92.4% ，97.21%，88.84%与89.61% ；其编码的氨基酸序列除与牛的同源性为99.07% 外，与其他哺乳动物同源性为 100%。而且，其蛋白质的高级结构除牛外其它物种也具有一致性。结论 无论是从RPL10基因的序列、结构、功能位点 ，还是从其编码的氨基酸的序列和二级结构进行分析，都表明大熊

4、猫的RPL10蛋白基因和已报道的哺乳动物的RPL10 蛋白基因具有高度的遗传稳定性和功能一致性。关键词 大熊猫； RT-PCR；RPL10； 克隆； 序列分析cDNA cloning and sequence analysis of ribosomal protein L10 gene (RPL10)from giant pandaSu Xiulan , Hou Yiling, Li Jun, Sun Bing, Wu Guangfu, Song Yan, Zhang Tian,Hou Wanru(College of Life Science, China West Normal Unive

5、rsity, Nanchong 637002, China)Abstract Objective To explore the structure of ribosomal protein L10 (RPL10)gene of giant panda (Ailuropoda melanoleuca)and investigate its homologies with other already reported sequences，including Homo sapiens and other mammalian. Methods According to the reported par

6、t of the mammalian subunit ribosomal protein L10 gene (RPL10) information, designing primers, then, cloning and sequencing the ribosomal protein RPL10 gene sequences from the total RNA of the giant panda in Muscle tissue ,using RT-PCR technique. The sequence data were analyzed by GenScan software,wh

7、ich can presume the cloned gene sequence of amino acid sequence;Open reading frame (ORF) RPL10 of the DNA sequence was searched using ORF finder software; Protein structure of the sequence cloned RPL10 was deduced using Predict Protein software. Results The full length of the sequence fragment was 6

8、85 bp containing an ORF of 645 bp. The deduced protein sequence showed that the protein was composed of 214 amino acids and its estimated molecular weight was 24.5997 kDa with a pI of 10.74. There were 4 different patterns of functional sites:two Protein kinase C phosphorylation sites; two N-myristo

9、ylation site; two Amidation site site;one Ribosomal protein L10e signature site. Further analysis indicated that the sequence of RPL10 and the protein encoded were highly homologous to some mammals reported,which are homo sapiens、bos taurus、canis familiaris、rattus norvegicus and mus musculus.The fom

10、er respectively are 92.4%,92.4%,97.21%,88.84% and 89.61%;the latter are 100%,except 99.07% of bos taurus. Moreover,the high-level structure of the RPL10 protein except bos taurus are also consistent. Conclusion Either from the RPL10 gene sequence, structure, functional site, or its encoded amino aci

11、d sequence and secondary structure analysis showed that the Ailuropoda melanoleuca RPL10 gene has a high degree of genetic stability and function of consistency with RPL10 gene in mammals which have been reported. Significance This study provide scientific material for enriching and improving the ma

12、mmals RPL10 gene database.Key words Ailuropoda melanoleuca; RT-PCR; ribosomal protein L10;cloning;sequences analysisSupported by the National Natural Science Foundation of China (30872270),Corresponding author: Hou Wanru, E-mail：基金项目 国家自然科学基金资助项目 (30470261); 四川省应用技术资助项目 (2006J13-057); 四川省教育厅重点科研项(07

13、ZA120); 四川省重点学科动物学建设经费资助 (404001)；四川省应用基础项目（2009JY0061）;四川省教育厅青年基金项目（092B088 ）通信作者 侯万儒，E-mail：核糖体是细胞合成蛋白质的细胞器，主要成分是蛋白质和 RNA，其主要功能是按照 mRNA 的指令由氨基酸高效且精确的合成蛋白质多肽链。真核生物的核糖体中约有 80 种核糖体蛋白亚基 1，其中核糖体蛋白的命名与蛋白在核糖体的大小亚基有关，小亚基（40S 亚基）核糖体蛋白命名为 S1 至 S31，大亚基（60S 亚基）核糖体蛋白命名为 L1 至 L442-3。核糖体 RPL10 是 60S 亚基的组成部分，属于核糖

14、体蛋白 L10e 家族成员。研究表明，核糖体蛋白基因RPL10 的突变与自闭症的发病机制有关 4。以国宝著称的大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是世界上现存最古老的物种之一，也是我国特有的珍贵稀有动物，属国家一级濒危保护动物。长久以来，其生存和保护现状一直为世人所关注的焦点，国内外学者从繁殖、生理和细胞等方面对大熊猫开展了大量的研究 5-7。目前，国内外对大熊猫基因的研究报道已有多篇 8-15，但并未见到关于 RPL10 基因的报道。本研究根据人（Homo sapiens） 、牛(Bos Taurus)、家犬 (Canis familiaris)、褐家鼠（Rattus no

15、rvegicus） 、小家鼠(Mus musculus)5 个哺乳动物物种 RPL10 基因表达序列的相关信息设计引物， 以大熊猫骨骼肌为材料,运用 RT-PCR 技术，对大熊猫RPL10 基因进行了扩增，克隆和测序， 分析了该表达序列所编码蛋白的序列特征，并与其他哺乳动物物种进行了相似性比较，为开展大熊猫分子生物学研究，尤其为 RPL10 结构基因的克隆与比较研究提供基础资料。1 材料和方法1.1 材料及试剂 大熊猫骨骼肌组织取自四川卧龙中国保护大熊猫研究中心死亡的大熊猫，为防止 RNA 降解，所取组织立即冻存于液氮中。总 RNA 抽提试剂盒 Total Tissue/cell RNA Ex

16、tractiob Kits 购自 Waton 公司； 逆转录试剂盒 Reverse Transcription System 购自 Promega 公司； 胶回收试剂盒购自 OMEGA 公司；T 载体试剂盒 ( PMD218T Vector Systems) 及限制性内切酶 Pst I,Sca均购自宝生物 (大连)有限公司；Taq plus 聚合酶购自上海生物工程公司；其他试剂均为国产分析纯。宿主菌 E.coli DH5 由四川省野生动植物保护与利用重点实验室保存。1.2 方法 13-15 1.2.1 总 RNA 的提取 取 3 mm 3 mm 3 mm 左右的样品组织，液氮中充分研磨，按照抽

17、提试剂盒说明书提取总 RNA。将所提总 RNA 溶于经 DEPC 处理过的水中， 保存于- 70 备用。1.2.2 引物设计及 RT-PCR 从 GenBank 数据库中检索到人（ Homo sapiens，NM_006013） 、牛( Bos Taurus， NM_174760 )、家犬(Canis familiaris， XM_862548)、褐家鼠（ Rattus norvegicus， NM_031100） 、小家鼠( Mus musculus， NM_052835) 5 个哺乳动物物种 RPL10 基因的 mRNA序列，根据其 mRNA 序列的同源性，利用 Primer Premie

18、r 5.0 软件对引物进行设计后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所设计引物编号及序列如下：上游引物 RPL10-F:5-CCACTGAAGATCCTGGTGTC-3下游引物 RPL10-R:5-GACAGGAAATAGTATTTATT-3以所提总 RNA 为模板,按逆转录试剂盒操作手册进行 cDNA 第 1 链的合成 反应总体积 20L：模板 1g，dNTPs1 mmolL 1， MgC12 5mmol L- 1， Oiligo(dT)15 0.5g ，AMV反转录酶 250.05 nkat， RNA 酶抑制剂 166.7 nkatL - 1。反转录条件：42 60 min，再适量取

19、第 1 链产物为模板，采用 25L PCR 反应体系进行 PCR 扩增，各成分浓度为：MgC12 1.5 mmolL- 1，dNTP 0.2 mmolL 1，上下游引物各 0.3molL -1， Taq plus 聚合酶 83.35 nkat。反应条件:94 5 min， 94 1 min， 52 0.5 min，72 1.5min，32 个循环；72 10 min。此过程重复 3 次，以得到3 个 RT-PCR 反应产物，然后用质量分数为 1 %的琼脂糖凝胶电泳检测 RT-PCR 反应产物，并于- 20保存。1.2.3 cDNA 的克隆及鉴定 分别对 3 个 PCR 产物进行回收纯化，用 S

20、ma I 限制性内切酶酶切并平端化质粒 pUC18 片段，将回收产物与酶切并平端化后的质粒片段连接，22 连接过夜。按常规方法转化感受态细胞，再涂于含氨苄青霉素、IPTG 及 x2gal 的 LB 培养基上过夜培养，用接种针挑取 5 个白色菌落，碱裂解法提取质粒，采用双酶切(Pst I 和 Sca II)和 PCR 这 2 种方法对重组质粒进行鉴定。经鉴定的阳性重组质粒由北京华大生物科技发展有限公司测序。1.2.4 数据处理 采用 Genescan 软件，对所克隆的基因序列进行氨基酸序列推定；采用 ORF finder 软件进行 DNA 序列的开放阅读框（ORF）查找； 采用 DNAMAN V

21、ersion 6 对基因序列和氨基酸序列进行同源性比较；采用 ExPASy Proteomics Server 软件进行蛋白质功能位点和生化特性预测分析；通过http:/www.imtech.res.in/raghava/apssp2/ 进行蛋白质二级结构的分析。2 结果2. 1 RT -PCR 产物用琼脂糖凝胶（质量分数为 1%）对 3 个 RT-PCR 扩增产物进行电泳分离，可见清晰的特异性扩增条带.经重组质粒测序，结果显示所得 3 个序列长度与预期大小一致，即都为 685 bp。该序列提交到 GenBank，所得的登录号为：GU445331。2. 2 大熊猫 RPL10 基因的序列 预测

22、分析将所克隆的序列放在 NCBI 数据库中利用 BLAST 进行基因同源性检索，结果发现该序列与其他哺乳动物 RPL10 基因的 cDNA 序列具有很高的同源性，由此可证明所克隆的序列为大熊猫的 RPL10 的 cDNA 序列。进一步分析发现，该基因的开放阅读框（ORF ）为 645bp，编码 214 个氨基酸残基, 起始密码子为 ATG, 终止密码子为 TGA (图 1)，其中四个碱基 A，T，G，C 的质量分数分别为 24.7%，22.8 %， 25.1 %，27.4 % 。图 1 大熊猫 RPL10 基因的 cDNA 序列及其预测的氨基酸序列（：终止密码子）2.3 大熊猫 RPL10 蛋

23、白的结构分析与功能位点预测在对大熊猫 RPL10 基因的序列进行分析的基础上，采用 Proteomics Server 软件进一步对大熊猫 RPL10 基因所编码的蛋白质进行预测。经分析发现:大熊猫 RPL10 蛋白的相对分子质量为 24.5997kDa (除牛的 RPL10 蛋白的相对分子质量为14.5706kDa 外，其它四种哺乳动物的 RPL10 蛋白的相对分子质量也为 24.5997kDa)，PI 为 10.74（除牛的等电点为10.78 外，其它四种哺乳动物的 RPL10 蛋白的等电点也为10.74） ，含有 45 个带正电荷的氨基酸(K 赖氨酸和 R 精氨酸)和 20 个（仅牛含有

24、 19 个）带负电荷的氨基酸 (E 谷氨酸和D 天冬氨酸),其余氨基酸为非极性、疏水性氨基酸和极性、中性氨基酸。与此同时，采用 PredictProtein 软件对大熊猫RPL10 基因所编码蛋白的功能位点也进行预测并分析，结果发现大熊猫与人、牛、家犬、褐家鼠、小家鼠 RPL10 蛋白的功能位点完全一致，即该蛋白含有 2 个蛋白激酶 C 磷酸化位点，2 个 N 化位点,2 个酰胺化位点，1 个核糖体蛋白 L10 signature 位点( 图 2) 。11111 ：蛋白激酶 C 磷酸化位点； 111111111 ：N 化位点； 1111 : ：酰胺化位点; ：核糖体蛋白 L10e signat

25、ure； 11 多态位点Pa.Ailuropoda melanoleuca; Ho.Homo sapiens; Bo.Bos Taurus; Ca.Canis familiaris; Mu.Mus musculus; Ra.Rattus norvegicus; 图 2 大熊猫与 5 个哺乳动物物种 RPL10 蛋白的氨基酸序列比较2.4 大熊猫 RPL10 基因和蛋白的比较分析首先利用 DNAMAN Version 6 软件，对大熊猫、人、牛、家犬、褐家鼠、小家鼠这六个哺乳动物的 RPL10 基因的编码序列进行同源性比较。结果表明它们具有较高的同源性：大熊猫与人、牛、家犬、褐家鼠、小家鼠的 R

26、PL10 基因编码序列同源性分别为 92.4%，92.4%，97.21%，88.84% 与89.61%，其中大熊猫与家犬的 RPL10 基因的同源性最高，高达 97.21%。再利用 DNAMAN Version 6 软件，进一步对这六种动物的 RPL10 基因所编码的氨基酸序列进行同源性比较，结果发现大熊猫除与牛的 RPL10 基因所编码的氨基酸序列同源性为 99.07%外，它与其他 4 个哺乳动物的 RPL10 基因所编码的氨基酸序列同源性均为 100 %。2.5 大熊猫 RPL10 蛋白的二级结构分析通过 http:/www.imtech.res.in/raghava/apssp2/网址对

27、五个哺乳动物的 RPL10 基因所编码的氨基酸序列进行蛋白质二级结构的分析，结果表明：除牛的 RPL10 蛋白序列中，螺旋(Helix)占 23.83%，盘绕(Coil)占 55.14%，缠绕(Strand)结构占21.03%外， 大熊猫和其它四种哺乳动物 RPL10 蛋白序列中，螺旋，盘绕，缠绕结构各占 23.83%，54.67% ，21.50%。而进一步分析发现：除牛的 RPL10 蛋白的氨基酸序列在 192 位的脯氨酸为盘绕结构而大熊猫和其它四种哺乳动物为缠绕结构外，大熊猫和五种哺乳动物的二级结构完全一致。3 讨论RPL10是核糖体蛋白L10e 家族成员，除具有核糖体蛋白一般功能之外，该

28、基因的突变与自闭症的发病机制有关密切联系，研究RPL10基因可进一步探索它其它的功能。通过对蛋白亚基RPL10的理化性质，结构等比较发现我们克隆的RPL10基因确为大熊猫的基因。本研究分析结果显示，大熊猫与人等五个哺乳动物的RPL10 基因的编码序列及其所编码的氨基酸序列具有较高的同源性，将大熊猫 RPL10 基因的编码序列和人、牛、褐家鼠和小家鼠进行比较，发现存在不少变异位点，这些变异多由密码子第 3 位碱基的转换或颠换造成，不引起编码氨基酸的变化，属于同义突变。进一步分析方发现，这些突变也未引起大熊猫 RPL10 蛋白功能位点的改变，所以，大熊猫和人等四种哺乳动物所编码的 RPL10 蛋白

29、的氨基酸序列有相同位置、相同种类和相同数量的功能位点。同时，在对 RPL10 蛋白所编码的氨基酸的二级结构分析时表明，除牛的 RPL10 蛋白的氨基酸序列在 192 位的脯氨酸为盘绕结构而大熊猫和其它四种哺乳动物为缠绕结构外，大熊猫和其它五种哺乳动物的二级结构完全一致。从这个意义上讲, 无论是从 RPL10 基因的序列、结构、功能位点分析，还是从其编码的氨基酸的序列和二级结构进行分析，表明大熊猫的 RPL10 蛋白基因和已报道的哺乳动物的 RPL10 蛋白基因具有高度的遗传稳定性和功能一致性。运用分子生物学原理与相应的技术手段，本实验成功地扩增出大熊猫的 RPL10 基因的表达序列，并对其编码

30、序列和编码蛋白的氨基酸序列进行分析，进一步丰富和完善了哺乳动物的 RPL10 基因库，为克隆大熊猫的 RPL10 基因的结构基因和进一步研究其功能以及分子多态提供了基础资料。此外，RPL10 蛋白基因高度的遗传稳定性和功能一致性为进化树的构建提供了基础依据。参考文献：1Wool I G. The structure and function of eukaryotic ribosomesJ. Annu Rev Biochem，1979，48:719-754.2刘志华，杨 谦. 球毛壳菌 60S 核糖体蛋白 L10a 基因克隆与特性分析J . 微生物学通报，2006，33 (1) :24-28.

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37、5.1% 重合文字来源 文献来源 作者 文字复制比 时间大熊猫核糖体蛋白 S12 亚基基因 北京师范大学学报 张田;郝彦哲;侯万 26% 2009-08-15(rpS12)的 cDNA 克隆及序列分析 (自然科学版) 儒;大熊猫核糖体蛋白亚基 RPS7 基因的克隆及序列分析 第三军医大学学报 侯怡铃;伍春莲;侯万儒;郝彦哲;张田;22% 2009-09-30大熊猫核糖体蛋白 S26 亚基基因(rps26)的 cDNA 克隆及序列分析 北京师范大学学报(自然科学版) 侯怡铃;孙冰;侯万儒;21% 2010-04-15大熊猫 RPS15 cDNA 的克隆及序列分析 四川动物 罗晓燕;胡锦矗;侯万儒;20% 2008-03-30大熊猫酸性核糖体磷酸蛋白 P1 基因cDNA 克隆及序列分析 兽类学报 杜玉杰;侯万儒;彭正松;周材权;11% 2008-02-15大熊猫 LSM3c DNA 序列的克隆及序列分析 四川动物 郝彦哲;侯万儒;杜玉杰;张田;11% 2009-03-28大熊猫(Ailuropoda melanoleuca) RPS24 基因 cDNA 克隆及序列分析 西华师范大学学报(自然科学版) 杜玉杰;侯怡铃;郝彦哲;张田;侯万儒;9% 2009-06-20