基因工程实验技术.doc

1、分子生物学实验技术目录实验一 细菌的培养 .2实验二 质粒 DNA 的提取 .3实验三 紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 .4实验四 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA.5实验五 质粒 DNA 酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 .7实验六 植物基因组 DNA 提取、酶切及电泳分析 .8实验七 聚合酶链反应（PCR ）技术体外扩增 DNA .9实验八 RNA 提取与纯化 .11实验九 RT-PCR 扩增目的基因 cDNA .13实验十 质粒载体和外源 DNA 的连接反应 .15实验十一 感受态细胞的制备及转化 .16实验十二 克隆的筛选和快速鉴定 .18实验十三 DNA 分析 Southern 杂交 .19

2、一 基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒 DNA 提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA实验五、质粒 DNA 酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组 DNA 提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物 RNA 提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链 式反应（PCR ）技术体外扩增 DNA实验九、RT-PCR 扩增目的基因 cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源 DNA 的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA 分析Southern 杂交实验一 细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培

3、养基的配置。二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。大肠杆菌是含有长约 3000kb 的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以 2030min 复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 11092109/mL。培

4、养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是 LB 培养基。三、实验材料、试剂与主要仪器（一） 实验材料大肠杆菌（二） 试剂1、胰蛋白胨2、酵母提取物3、氯化钠4、1mol/L NaOH5、琼脂粉6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1、培养皿2、带帽试管3、涂布器4、灭菌锅5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6、恒温摇床四、操作步骤（一）LB 培养基的配制配制每升培养基，应在 950m1 去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨 10g细菌培养用酵母提取物 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用 1mol/L NaOH 调节 pH 位至 7.0。加入去

5、离子水至总体积为 lL，在 15 lbfin 2 (1.034105Pa)高压下蒸气灭菌 20min，即为 LB 液体培养基。LB 固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉 15g/L。（二）细菌的培养（）在液体培养基中培养1、过夜培养取 5ml 液体培养基加入一只无菌的试管中。用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。盖好试管，在摇床上以 60r/min 速度，于 37过夜培养。、大体积培养按 1100 的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的 5 倍以上。于 37，约 300r/min 剧烈摇动培养。（）在固体培养基中培养 细菌在固体培养基上培养主要是为

6、了获得单菌落和短期保存。平板划线法分离单菌落采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。于 37培养直至长出单菌落。实验二 质粒 DNA 的提取目的学习碱裂解法提取质粒的原理原理质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的 DNA 分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具载体。质粒 DNA 的提取是依据质粒 DNA 分子较染色体 DNA 分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒

7、DNA 与大肠杆菌染色体 DNA 分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒 DNA 氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当 pH=4.8 的乙酸钠将其 pH 调到中性时，变性的质粒 DNA 又恢复到原来的构型，而染色体 DNA 不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体 DNA与大分子 RNA、蛋

8、白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。试剂与器材一、试剂1、LB 液体培养基：胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，溶解于 1000mL 蒸馏水中，用 NaOH 调 pH 至 7.5。高压灭菌 20min。2、LB 平板培养基：在每 1000mL LB 液体培养基中中加入 15g 琼脂，高压灭菌20min。3、溶液：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。4、溶液：0.2mol/L NaOH,1% SDS。 （必须现配）5、 溶液：pH4.8 的醋酸钾溶液（5mo1L 乙酸钾 60 mL，冰乙酸 11.5 m

9、L，水 28.5mL） 。6、TE 缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl,1mmol/ L EDTA。7、无水乙醇和 70%乙醇。二、器材1、 Eppendorf 管、离心管架2、 10，100，1000 ul 微量加样器3、 台式高速离心机4、 摇床、高压灭菌锅5、 大肠杆菌 DH5（含质粒）操作步骤一、培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于 LB 平板培养基上，3724h， 然后从平板上挑取单菌落，接种于 5mL 液体培养基中，3712h。二、提取步骤1、将菌液移入 1.5ml 离心管，8 000 rpm1min，倒置于滤纸上，彻底除去残液。2、加入 100 ul 预冷

10、的溶液，用涡旋震荡器充分悬浮菌体。3、加入 4 ul RNase ，室温2 min。4、加入 200 ul 溶液，快速颠倒，温和混匀，冰浴 5min。此时溶液应非常粘稠。5、加入 150 ul 预冷的溶液，温和混匀（此时应有可见沉淀） ，冰浴 5 min。6、12 000 rpm5min。转移上清液至另一 1.5ml 离心管中。7、上清液加入 2 倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-2020min。8、12 000 rpm5min，彻底除去残液。9、加入 500 ul 70% 乙醇洗 DNA 沉淀。3 000 rpm1 min，彻底挥发除去乙醇。10、加入 40 ul ddH2O 溶解 DNA，待用

11、。 （或用 TE 溶解， -20保存） 。实验三 紫外吸收法测定核酸浓度与纯度一、目的学习测定 DNA 或 RNA 的浓度与纯度。二、原理核酸分子中的碱基集团含有共轭双键，它们对紫外光有强烈的吸收。核酸的最大吸收波长在 260 nm，吸收低峰在 230 nm。可以利用核酸的这一特性对其浓度进行测定。在波长 260 nm 下，A 260=1 时，双链 DNA 的含量为 50 g/ml，单链 DNA 为 33 g/ml ，RNA 为 40 g/ml，寡聚核苷酸为 2030 g/ml。测出核酸溶液在 A260的值，即可得出浓度。根据经验数据，纯得 DNA A260/A280=1.8,纯的 RNA A

12、 260/A280=2.0.若样品中含有蛋白或其它杂质会使其比值下降。三、试剂与仪器（一）试剂 TE 缓冲溶液（二）仪器 紫外分光光度计四、操作步骤1、 开机，选择波长开机前应先检查光路中有无障碍物。然后开启电源开关预热 20 左右。并调节波长在260 nm 下。2、选择 A 档，调零面表上有 4 个可供选择的模式，本实验选择测定 A 值，因此选择 A 模式。待测核酸为水或 TE 溶液，选择水或 TE 做空白对照进行调零。3、测定样品将待测样品做适当稀释，用仪器配套的石英比色杯，以水或 TE 为对照的条件下测定，读取并记录样品 A260 的值。4、 计算样品的浓度双链 DNA 浓度=50g/m

13、lA 260稀释倍数单链 DNA 浓度=33g/mlA 260稀释倍数单链 RAN 浓度=40g/mlA 260稀释倍数核酸总量=样品浓度样品体积（ml）实验四 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA目的学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测 DNA 的纯度，DNA 的构型，含量以及分子量的大小。原理水平式琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的 DNA 就能检测，其分辨效果比分光光度计法与溴化乙啶 -标准浓度 DNA 比较法更高，更直接，检测 DNA 范围更广，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当 DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的 EB 就插入 DNA

14、 分子中形成荧光络合物；使得DAN 发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于 DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，则可精确地测得样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需510ng DNA ，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到 0.010.1ng 的 DNA。在凝胶电泳中，DNA 分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。质粒 DNA 样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准 DNA 片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的 DNA，也可

15、鉴别分子量相同，但构型不同的 DNA 分子。在抽提质粒的过程中，由于各种因素的影响，使得超螺旋共价闭环结构的 DNA（SC）的一条链断裂，变成开环（OS）分子，如果两条链发生断裂，就变成线形分子（L）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋迁移速度最快，其次为线形分子，最慢的为开环分子。当提取到的质粒 DNA 样品中还有染色体 DNA 或 RNA，在琼脂糖电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可以分析样品的纯度。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在

16、电场中向着正极移动，在用电泳法检测 DNA 分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。试剂与器材一、试剂1、 DNA 样品2、 TBE 缓冲液（5）：用时需稀释 10 倍3、 点样缓冲液 Loading buffer（10）：0.25%溴酚蓝，40%甘油4、 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml 溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。5、 琼脂糖二、器材1、 电泳仪系统2、 紫外灯3、 恒温水浴箱操作步骤1 选择合适的水平式电

17、泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。2 选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为 0.51.0mm。3 制备琼脂糖凝胶：按照被分离的 DAN 分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下可参考下表：琼脂糖的含量（%）g/ml分离线状 DNA 分子的有限范围(kb)0.3 6050.6 2010.7 100.80.9 70.51.2 60.41.5 40.22.0 30.1称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约 40ml 凝胶液，置微波炉中或水浴加热，至琼脂糖融化均匀。4 将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，在一端插好梳

18、子。待凝胶溶液冷却至 60 左右时，在凝胶溶液中加 EB（EB 最终浓度为 0.5 g/ml） ，摇匀，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入 TBE 缓冲液） ，然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。注意：电极缓冲液要高出凝胶面 2-5。5 待测的 DNA 样品中，加入 1/5 体积的点样缓冲液，混匀后小心的进行点样，记录样品点样顺序和点样量。6 开启电源开关，最高电压不超过 5V/cm。7 电泳时间看实验的具体要求而异，在电泳中途可用紫外灯直接观察，DNA 各条区带分开后电泳结束。一般 20min3 h，取电泳凝胶块直接拍照。实验五 质

19、粒 DNA 酶切及琼脂糖电泳分析鉴定原理限制性内切酶可以识别双链 DNA 特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于 DNA 片段再连接。限制性内切酶对环状质粒 DNA 有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量 DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知 DNA 的相对分子质量。质粒 DNA 在细胞内有三种构象：共价闭环 DNA，常以超螺旋形式存在；如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环

20、DNA；线状 DNA，双链 DNA 断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环 DNA 迁移率最大，其次是线状 DNA 和开环 DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现 23 条区带。试剂与器材一、试剂1、EcoR酶2、DNA3、TBE 缓冲液（5）：用时需稀释 10 倍4、 点样缓冲液 Loading buffer（10）：0.25%溴酚蓝，40%甘油5、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml 溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。6、 琼脂糖二、器材1、电泳仪系统2、紫外灯3、恒温水浴箱操作步骤一、质粒 DNA 酶切1、 按下表将各种试剂分别加入每个 Eppendorf 管中，要注意

21、管号。2、 加 样后混匀， 置于37水浴 中，保温 2 h。然后 每个管中 迅速加入 2 ul EDTA终止反应。二、琼脂糖凝胶电泳1、 琼脂糖凝胶的制备（1）称 0.4g 琼脂糖加 40ml 0.5 X TBE 缓冲液,加热熔解。冷却至 60加 2 ul EB，混匀。2、 胶板制备将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，然后倒入熔好的琼脂糖，并在一端插好梳子。待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽，垂直拔掉梳子。注意：电极缓冲液要高出凝胶面 2-5。3、 加样每个样品中加入 1/10 体积 Loading buffer（10） ，混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。4、 电泳观察

22、接通电源，电压为 80V1h 左右，当溴酚蓝到达下沿 1-2处时，停止电泳。5、 观察及照相将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下。在紫外灯下观察结果，如果有条件也可用凝胶成像系统照相。实验六 植物基因组 DNA 提取、酶切及电泳分析目的掌握植物基因组 DNA 提取的一般方法及注意事项。大分子量 DNA 分子的酶切分析。管号 质粒 DNA 10 10 10EcoR/ ul 1 1酶切 Buffer（10）/ ul 2 2 2ddH2O/ ul 8 7 6RNA 酶 1原理十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可

23、溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇。试剂与器材一、试剂1 、DNA extraction ：500ml31.885g sorbitol (山梨醇)6.05g tris PH8.2 (一般不调)2、Nuclei lysis buffer: 500ml100ml 1M Tris PH7.5100ml 0.25M EDTA200ml 5M NaCl10g CTAB100ml ddH203、5% s

24、arkosyl (N- 月桂酰肌氨基钠盐) 500ml用时，将上述三种溶液按 1：1：0.4 比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l）,65预热，既为抽提液。二、器材操作步骤一、基因组 DNA 提取1、取 0.15g 左右小麦叶片，在液氮中迅速研磨后放入 1.5ml 离心管中，加入 700ul 抽体液（65预热）混匀， 65水浴裂解 40-60 min，期间温和混匀几次，加 4 ul RNase 室温静置 2min。2 裂解好的 DNA ，加入 500 ul 氯仿：异戊醇（24：1） ，缓慢混匀，411 000rpm10min。3、取上清于新管中， （不要混入氯仿） ，加入 0.8-1 倍预冷

25、异丙醇，缓慢混匀后再猛烈混匀，使 DNA 成团，-20静置 30 min。4、将析出的 DNA 离心，411 000rpm10 min。5、去掉上清，将沉淀用 500ul 70% 乙醇清洗一次，6、3000 rpm1 min, 彻底挥发除去乙醇，溶于 40ul ddH2O。二、酶切及电泳分析管号 基因组 DNA/g 1 1植物基因组 DNA 10 10 10 10EcoR/ ul 1 2 2 2EcoRBuffer（ 10） 2 5 5 5Hind III / ul 1 2 2 2Hind III Buffer（10）2 5 5 5ddH2O/ ul 26 26 13 13 6 537反应 4

26、h，迅速加入 2 ul EDTA 中止反应。0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样） 。实验七 聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增 DNA目的1、学习 PCR 反应的基本原理和实验技术。2、了解引物设计的一般要求。原理聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成 DNA 片段的一种技术。利用 PCR 技术可在数小时之内大量扩增目的基因或 DNA 片段，以用于基因工程操作。PCR 进行的基本条件：DNA 模板（在 RT-PCR 中模板是 RNA） ；引物；dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）Taq DNA 聚合酶PCR 循环由三个步骤组成：

27、变性 使模板 DNA 解离成单链；退火 使引物与模板 DNA 所需扩增序列结合；延伸 DNA 聚合酶利用 dNTP 合成与模板碱基序列互补的 DNA 链。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过 30 个左右循环后，目的片段的扩增可达 106 倍。引物设计：要保证 PCR 反应能准确，特异，有效的对引物 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：引物长度：1525 个核苷酸； CG 含量为 40%60%；Tm 值为 55（Tm=4（C+G）+2 （A+T）计算；引物与非特异配对位点的配对率小于 70%；引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于 3，两条引物间配对碱基数小于 5 个。由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。本实验以实验一中提取的质粒 DNA 为模板，进行 PCR 扩增，大量得到目的 DNA 片段。试剂与器材一、试剂1、 Taq DNA 聚合酶RNA 酶 1