牛病毒性腹泻与粘膜病.ppt

1、牛病毒性腹泻与黏膜病,牛病毒性腹泻，又称牛病毒性腹泻/粘膜病，是由BVDV引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反刍动物及猪的一种重要传染病。临床主要表现为发热、粘膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染、咳嗽及怀孕母牛流产或产生畸形胎儿。同一种病原引起的多种病状的传染病 我国1980年李佑民首从国外进口奶牛分离出BVDV；上世纪90年代郑志刚等在全国范围内调查，BVDV平均阳性率为19.56%，近年来本病在国内阳性检出率呈逐年上涨的趋势。本病给养牛业造成明显损失（产乳、重、流产等）。,牛病毒性腹泻,BVDV的流行病学,BVDV的病原学,BVDV的基因结构及其蛋白,BVDV的研究进展,内容摘要,BVDV

2、的防治,BVDV的主要诊断方法,BVDV的流行病学,传 染 源：病牛和带毒牛是主要传染源。传播途径：主要通过消化道和呼吸道传播；直接或间接接触也可以传播；吸血昆虫也是重要的传播媒介。易感动物：主要感染牛（肉牛、奶牛），也可感染猪。 本病多发于寒冷季节，过分拥挤可促进本病发生。,BVDV的病原学,属黄病毒科、瘟病毒属有囊膜，直径25-30nm，正链RNA胎牛肾、睾丸、猪肾、胎羊睾丸可增殖传代 BVDV。BVDV 可以分成致细胞病变型（CP）和非致细胞病变型（NCP）。,BVDV的基因结构及其蛋白,5-Npro（P20）-C(P14)-Erns(gp48)-E1 (gp25)-E2(gp53)-P

3、7- NS2-3 (P125)-NS4A (P10)- NS4B (P30)- NS5A (P58)- NS5B (P75)-3,其中C，ERNS，E1，E2是病毒的结构蛋白。其余为非结构蛋白。,BVDV的主要基因、蛋白研究进展,核衣壳组成成分，具有免疫原性,BVDV 基因组具有较高的保守性,瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、病毒RNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有重要作用,5-UTR,C,NS3,ERNS,内有一高度保守结构域，可用于研究亚单位疫苗，也可作为基因工程诊断抗原,E2,与抗BVDV抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸附的主要部位,Npro,具有自体蛋白酶活性，有较高的

4、保守，可以对瘟病毒进行种、群或型的鉴定,5-UTR：5末端无甲基化的“帽子”结构，5-UTR序列在BVDV的各毒株间有较高的保守性，因此常根据5-UTR的序列设计引物来检测 BVDV或对 BVDV 进行分型。5-UTR 在病毒转录、翻译过程中起重要的作用。2010年张兴娟等分别用5-UTR设计一对引物，预扩增片段125bp；2010年孟雨等人也利用5-UTR设计一对引物，预扩增片段218bp，实验证明利用5-UTR设计引物具有很好的特异性和敏感性。,E2：是BVDV的主要保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体，所以新型疫苗都是针对E2结构蛋白的。也是与抗 BVDV 抗体结合、介导免疫中和反应及与宿

5、主细胞识别、吸附的主要部位，E2 基因一直是国内外学者研究瘟病毒的重点。E2 是形成 BVD 基因工程疫苗的最好的选择。BVDV E2 DNA 疫苗是近年来 BVDV 免疫研究的热点。如2007吴明福等构建真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-E2 并免疫小鼠，可诱导小鼠产生一定程度的体液和细胞免疫应答。,NS-3：NS3区域与病毒的毒力，生长特性有关。NS3在瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、病毒RNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有重要作用。NS3的表达与宿主细胞CPE的产生有密切关系。2009年魏伟等用BVDV NS3 蛋白中有免疫反应性的重组片段作为包被抗原，建立了一个 BVDV 抗体

6、检测的间接 ELISA 方法。,血清学诊断,免疫学诊断,诊断方法的进展,分子生物学诊断,1,2,3,血清学诊断,常见的方法为主要包括血清中和试验和琼脂扩散试验两种。 琼脂扩散试验准确性较低，检出的结果常常有假阳性。 血清中和试验重复性高，准确性好，已作为 BVDV 诊断的“金标准”，但血清中和试验在基层使用时，常遇到费时、费力，需要细胞培养等试验室技术问题，无法得到推广。,免疫学诊断,免疫荧光技术（IFA）,免疫过氧化物酶技术（IP）,免疫荧光技术（IFA）,免疫荧光技术（IFA）又称荧光抗体技术，可用于检测细胞培养物以及病变组织的冰冻切片中 BVDV 感染情况。 免疫荧光抗体技术特异、敏感、

7、快速，但它需要荧光显微镜，使得此技术无法得到推广应用。,ELISA,ELISA 常被用于检测组织器官培养物中 BVDV，监测牛群中 BVD 抗体水平，评估潜伏感染情况。其中最常用的是双抗夹心 ELISA 和间接 ELISA，也有使用 BVDV 单克隆抗体与 ELISA 联合诊断 BVD。 研究较多的IBRV诊断蛋白有NS3，E2蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）,免疫过氧化物酶技术（IP）诊断 BVDV 准确、可靠，可用于了解 BVD 的总体分布情况。链酶亲和素-生物素过氧化物酶检测方法，可以用来检测福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中的BVDV。,近年来，为了避免非特异性染色反应，则可以使用单

8、克隆抗体+生物素化抗鼠抗体-链酶亲和素过氧化物酶检测方法。,免疫过氧化物酶技术（IP）,分子生物学诊断,RT-PCR,核酸探针检测,1,2,RT-PCR,RTPCR 是目前广泛应用的分子生物学技术，对于检测 BVDV 的 RNA 是一个合适的方法。根据 BVDV 基因组序列合成一对或几对特异性引物，可以高度特异、敏感的检测出器官、组织、细胞培养物中的 BVDV，并可区别 CSFV、BDV，还可对 BVDV 的基因型和生物型作进一步的鉴定,PCR引物多数选在BVDV保守区5-UTR和NS3基因内，尤其5UTR是BVDV进行鉴定、基因分型的首选区域。 2007年王伟利建立了 BVDV 荧光 RT-

9、PCR 检测方法并进行了初步应用，2007年国家质量监督检验检疫局制定了牛病毒性腹泻/黏膜病反转录聚合酶链反应操作规程,核酸探针检测（NAH）,与传统方法相比，该技术敏感，特异性强，而且应用很广泛，NAH 可直接检测脏器组织和血细胞中的 BVDV。NAH 技术应用最广泛的是核酸标记法，按核酸探针标记物不同可分为两类：一类是放射性同位素（如 32P，35S）标记的 DNA 探针，另一类是用如地高辛、生物素标记的 DNA 探针。核酸探针技术标记简单，特异性好，可长期保存，并且可以回收利用，制成试剂盒，是一种安全、快速、经济的诊断方法。,预防和控制,免疫预防和药物治疗健全完善 BVD 检测体系，加强检测牛群及牛源生物制品的 BVDV 污染情况排除掉持续性感染牛等隐性感染动物加强环境监控，在饲养环节加强管理，建立封闭式牧场管理系统，不进行混合饲养实施免疫预防、过度到捕杀根除程序,Thank You !,