共聚焦显微镜-北京大学单分子与纳米生物学实验室.ppt

1、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介,He XiaohuiSu Meng 90513103Li Wei 90513104,Introduction LSCM 是一种高科技显微镜荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。无损伤的“光学切片”细胞三维立体机构实时动态分析监测,光学显微镜部分激光发射器扫描装置光检测器计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件) 图像输出设备,LSCM的基本组成,LSCM的原理,LSCM对生物样品的观察的优越性：连续扫描 三维离子荧光标记同时多重物质标记,LS

2、CM的发展,滤片式LSCM 棱镜狭缝分光式LSCM,LSCM在医学及生物学研究中的应用,LSCM常用于生物细胞或组织内的分子原位鉴定和定量,细胞及亚细胞结构形态学观察; 以及活体细胞或组织功能的动态监测. 在生命科学领域的分子水平,细胞及组织水平的研究中得到广泛应用.,一 原位鉴定细胞或组织内生物大分子,观察细胞及亚细胞形态结构,在细胞原位用特异探针标记出核酸,蛋白质,多肽,酶,激素,磷脂,多糖,受体等分子并用激光扫描共聚焦显微镜成像,从而实现上述大分子的定位,定性及定量检测,(一)在细胞原位检测核酸(二) 原位检测蛋白质,抗体及其他分子(三)检测细胞凋亡(四)细胞器观察及测定(五)检测细胞融

3、合(六)观察细胞骨架(七)检测细胞间缝隙连接通讯(八)检测细胞内脂肪,(一)在细胞原位检测核酸,检测核酸的荧光探针1 碘化丙啶 (PI)-不能进入完整的细胞膜2 Hoechst33342,Hoechst33258 和DAPI3 AO(吖啶橙),(二) 原位检测蛋白质,抗体及其他分子,常用的荧光探针:1 荧光染料FITC: 蓝光激发,发出明亮绿色荧光2 罗丹明: 比FITC光稳定性好,在生理条件下对PH变化不敏感,荧光强度受细胞自发荧光的干扰较小,3 绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）,*可对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察,(三)检测细胞凋亡,通

4、常用的方法:1 细胞核形态观察2 脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)3 Annexin-V试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法,(四)细胞器观察及测定,不同实验目的,标记细胞器的方法也不同.,1线粒体 Mitochondria Rodamin 123 Mitotracker Green FM Mitotracker Orange CMTMRos Mitotracker Orange 2 溶酶体 Lysosome 中性红 AO LysoTracker Green DND-26 / Blue/ Red3 内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC64 高尔基体

5、Golgi apparatus NBD C6-ceramie,(五)检测细胞融合,根据不同细胞的特性,将每一种细胞特有的物质用不同的荧光控针标记;融合操作后,确认不同的荧光信号是否发生共定位于同一细胞;如在同一细胞中同时检测 到上述不同的荧光信号,则说明已经发生了细胞融合.,(六)观察细胞骨架,骨架(微丝,微管和中等纤维)直标: 一抗+荧光探针(如:肌动蛋白actin )间标: 二抗+荧光探针(如:微管蛋白tublin),肌动蛋白(Actin)标记肌动蛋白是微丝的基本成分 毒伞素(鬼笔环肽)-与多聚体肌动蛋白微丝专一性结合起来且亲和作用强烈.,微管蛋白(Tubulin)标记,(七)检测细胞间缝

6、隙连接通讯,染料荧光黄(LY)-黄色带电荷的小分子强荧光物质,不通过细胞膜,但可以很容易通过GJIC,从标记的细胞(划痕法)传输到邻近细胞.观察LY向邻近细胞的传输速率,用以表示GJIC连接通讯功能,漂白细胞(箭头标记)荧光漂白前(A)及漂白后0(B)、2(C)和4(D)min时的荧光恢复情况经瞬间漂白后细胞内荧光强度明显变弱随着时问的推移荧光逐渐恢复，至4 min时(D)可见荧光强度明显恢复,FRAP法测定膀胱平滑肌细胞GJIC功能,(八)检测细胞内脂肪,尼罗红(Nile red):是一个理想的脂肪染色剂,它只在疏水环境中显示很强的荧光.除了在所需显示的脂质中被溶解外,尼罗红与组织不发生任何

7、反应.,二 活体细胞或组织功能的实时动态监测,利用相应的特异荧光控针标记后观察单个细胞不同部位或不同组织区域接受刺激后的整个变化过程,(一)实时定量测定细胞内Ca2+的变化(二)测定细胞内PH变化(三) 检测膜电位的变化(四)检测细胞内活性氧物种的产生(五)检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位(六)检测荧光共振能量转移(FRET)(七)检测荧光漂白恢复(FRAP),Fluo-3较为常用,基本原理:a其乙酰羟甲基酯(AM)形式是Fluo-3AM,无荧光,为不带电荷的亲脂性化合物,易于渗透脂膜进入活细胞内 b在胞内被非特异酯酶水解,释放出游离酸形式的荧光探针分子,此游离态也无荧光,不易漏出胞外

8、c一旦与Ca2+结合后便形成复合物,并有较强的荧光产生,从而发挥其钙探针的作用.,KCL诱导的细胞外Ca+内流测量,培养/分离的细胞 20M Fluo 3-AM负载液30-60min 清洗、换液 扫描,(二)测定细胞内PH变化,常用的荧光探针有BCECF和6-COFDABCECF的激发光谱是PH依赖性的比例法:即分别用490nm和440nm光激发BCECF所得到的发射荧光之比(比例荧光与PH有很好的线性关系)最大分辩率为0.4PH单位.,(三) 检测膜电位的变化,快响应探针: 膜电位直接影响探针分子的电分布而改变其光谱,响应快慢响应探针: 主要通过改变其在膜内外的分布来对膜电位的变化作出反应.

9、跨膜运动需要一定的时间,所以反应慢.,依探针对电位变化响应速度,将电位敏感探针分为快响应探针和慢响应探针,(四)检测细胞内活性氧物种的产生,基本原理:a DCFH-DA进入细胞后b 经酯酶作用脱去二酯,生成不发荧光的DCFHc 被超氧阴离子,过氧化氢等活性氧化生成发荧光的DCF d 活性氧自由基的含量与荧光探针之荧光强度成正相关,DCFH-DA常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化,(五)检测药物等跨膜进入组织/细胞过程及定位,为检测药物分子,病毒,细菌等外界物质能否跨膜进入细胞/组织,需利用这些物质特异性自发荧光/对其进行荧光标记.,(六)检测荧光共振能量转移(FRET),由于荧光蛋白的

10、独特优点,其特定的荧光对理论上可用于活细胞中实时研究大分子间的相互作用.,荧光能量共振转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer),I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。,供体荧光素 受体荧光素,1.供体与受体间的距离 10nm或=1-7nm2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠,II.荧光能量共振转移的条件,488nm 520nm 650nm,供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3),供体荧光素 (Cy2) 受体荧光

11、素 (Cy3),(七)检测荧光漂白恢复(FRAP),FRAP:是将待测细胞用荧光物质标记,借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域,从而造成该区域荧光分子的光淬灭;通过低强度激光扫描成像,可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率.从理论上讲,凡是能够标记待测分子,并且能够发生荧光淬灭的荧光物质都可以使用.,1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递,激光扫描共焦显微镜的发展趋势,多光子激光扫描显微镜 Multiphoton Laser Scanning Microscopy在生

12、物及医学成像,单分子探测,三维信息存储,微加工等领域得到广泛应用,展示了广阔的发展前景.,多光子激光扫描显微镜简介,多光子激光器波长从700-1000nm连续可调 双光子波长：350-500nm 连续 三光子波长：230-330nm 连续应用：可直接清晰活体观察某些非标记神经递质的分泌 (5-HT) 或 NADPH的分布,双光子激光扫描荧光显微系统,照射光波长大于荧光染料吸收峰波长2倍 高能量(2KW)、超短脉冲(兆分之一秒)聚焦, 使聚焦点瞬间产生高密度光子, 出现双光子吸收激发荧光 双光子吸收仅发生在聚焦点, 避免了焦点外激发而产生的漂白现象高能量、超短脉冲聚焦、穿透性更强 50 m 500 m,488nm 520nm,FITC,976nm,多光子激光扫描显微镜优点与局限:,优点:1 对生物样品的光损伤小2 有效观测时间长3 穿透深度深4 荧光收集率高5 对探测光路的要求低6 适合多标记复合测量,局限:1 只能对荧光成像2 样品可能受到热损伤.(若样品含吸收激发光的色团,如黑色素)3 超快激光器较为昂贵,例4 长时间观察活体阿尔茨海默病模型 小鼠淀粉蛋白形成的状况,Thanks for your attentions!,Any questions?,