新型骨靶向磁共振成像造影剂的分析.pdf

1、 I 关于学位论文 独创声明和学术诚信承诺 本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 在此本人郑重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为，文责自负。 学位申请人（学位论文作者）签名： 201 年 月 日 关于学位论文著作权使用授权书 本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学

2、位论文的作者，本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文（纸质文本和电子文本）以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手段保存、汇编学位论文（纸质文本和电子文本）。 （涉及保密内容 的学位论文在解密后适用本授权书） 学位获得者（学位论文作者）签名： 201 年 月 日 学位论文指导教师签名： 201 年 月 日I 摘 要 磁共振成像造影剂在疾病诊断上有重要作用，但现有临床用造影剂缺乏组织靶向性、弛豫率低、稳定性差。骨肉瘤发

3、生率占骨肿瘤疾病的 35%，但目前临床无骨靶向磁共 振 成 像 造 影 剂 。 本 文 设 计 并 合 成 了 一 种 新 型 骨 靶 向 磁 共 振 成 像 造 影 剂Gd2-DTPA-bis(ALN)，进行了体内外评价，并与临床用造影剂马根维显（ Gd-DTPA, Magnevist）对照。 1. 新型骨靶向磁共振成像造影剂的设计与合成。将 骨靶向药物阿仑膦酸钠和临床用造影剂钆 -二乙基三胺五乙酸通过共价键偶联，通过多步化学反应，生成骨靶向造影剂钆 -二乙基三胺五乙酸双阿仑膦酸钠（ Gd2-DTPA-bis(ALN)），并用核磁、质谱、红外等方法进行结构鉴定。 2. 新型骨靶向磁共振成像造

4、影剂的含量测定。 骨靶向造影剂 Gd-DTPA- bis(ALN)分子内 无双键、苯环等结构，无紫 外吸收，现有光谱学等方法无法测定其含量。本文用电感耦合等离子体质谱法 （ ICP-MS） 测定造影剂中 Gd3+含量，进一步得到造影剂含量，测得 Gd3+的百分含量为 23.8%。该方法具有灵敏度高、操作方便等优点。通过考察DTPA-bis(ALN)的稳定性常数，得到 logKML为 23.17，与市售造影剂 Gd-DTPA的 22.46相近， 说明 Gd2-DTPA-bis(ALN)稳定性较好 。 3. 羟基磷灰石吸附骨靶向磁共振成像造影剂的研究。 羟基磷灰石是骨主要成分，测定 Gd2-DTP

5、A-bis(ALN)与 羟基磷灰石的 结合率 较高，平均吸附率为 39.925%， 市售造影剂 Gd-DTPA几乎与羟基磷灰石没有结合。因此我们制备的新型 造影剂具有很强的 羟基磷灰石 结合性能，也预测其在体内有较好骨靶向性。 4. 新型骨靶向磁共振成像造影剂弛豫率的测定。 顺磁性磁共振造影剂通过增强水质子的弛豫效率提高磁共振造影效果。在医用磁共振设备上显示， Gd2-DTPA-bis(ALN)的弛豫率为 3.806 mmol-1.L.s-1，高于市售药 Gd-DTPA的弛豫率 (2.718 mmol-1.L.s-1)。前者 弛豫率比后者高 1.4倍。该结果证明我们制备的新型造 影剂的磁共振成

6、像效果高于 市售药Gd-DTPA。 II 5. 新型骨靶向 磁共振成像 造影剂的小鼠急性毒性研究 。给小鼠静脉注射不同剂量Gd2-DTPA-bis(ALN)，观察毒理反应， 确定其半数致死剂量 （ ID50）为 0.66 g/Kg，零致死量为 0.375mmol/Kg， 100% 致死量为 3.0mmol/Kg。 6. 新型骨靶向磁共振成像造影剂的骨肉瘤细胞的靶向性研究。 Gd2-DTPA- bis(ALN)具有偕二膦酸基团，与破骨细胞和成骨细胞都有较强亲和性。用骨肉瘤细胞 UMR106作为模型，考察 Gd2-DTPA- bis(ALN) 和 Gd-DTPA 对细胞生长的影响，发现Gd2-DT

7、PA-bis(ALN)的浓度低于 10-5mol/L时，对细胞无影响；当浓度提高至 10-3mol/L时，能部分促进细胞增殖，而 Gd-DTPA无此作用。因此 Gd2-DTPA-bis(ALN)与骨肉瘤细胞有较强亲和能力。 7. 新型骨靶向磁共振成像造影剂的骨肉瘤动物模型的影像学研究。 裸鼠股骨远端胫骨近端注射骨肉瘤 UMR106细胞，建立原位骨肉瘤模型并通过 X射线影像确认。骨肉瘤模型裸鼠静脉注射造影剂后，在不同时间点通过磁共振成像仪进行影像学研究。Gd2-DTPA-bis(ALN)在 0 5min主要在血管中显影，在 25 50min主要在骨肉瘤显影，75min后主要在肝肾显影，说明药物被

8、排泄 。而对照药 Gd-DTPA在 0 5min主要在血管中显影，之后在各组织均有强度相当的显影。因此 与市售造影剂比较， Gd2-DTPA-bis(ALN)呈现明显增强的骨靶向磁共振显影 效果。通过 ICP-MS测定了不同时间点各主要组织中的 Gd，证明 Gd2-DTPA-bis(ALN)在裸鼠体内的分布和显影效果一致。 上述结果证明，本文成功制备了一种具有骨靶向性、高弛豫性、稳定、安全性好 的磁共振成像造影剂。 关键词： 偕二膦酸，骨靶向，钆 -二乙基三胺五乙酸，磁共振成像造影剂，骨肉瘤 III Abstract Magnetic resonance imaging (MRI) plays

9、 a key role in clinical diagnosis. However, currently clinically applied MRI contrast agents have no tissue targeting, low relaxation rate and weak stability. Osteosarcoma morbidity is high, occupying 35% of total bone tumors. No bone-targeted MRI contrast agents are presented in clinics. In this st

10、udy, a novel bone-targeted MRI contrast agent, Gd2-DTPA-bis(ALN), was designed and prepared. The in vitro/in vivo studies of it were performed. The clinically applied contrast agent, Gd-DTPA (Magnevist) was as control. 1) The design and synthesis of a novel bone-targeted MRI contrast agent. Through

11、a multi-step chemical reaction, alendronate which can target to bone, has been connected to Magnevist, a contrast agent used in clinic. We can get a novel bone-targeted contrast agent, Gd2-diethylenetriaminepentaacetate-bis(alendronate) (Gd2-DTPA-bis(ALN). 2) The quantitative analysis of the new bon

12、e-targeted contrast agent. The novel bone-targeted contrast agent Gd2-DTPA-bis(ALN) had no double bond structure, no ultraviolet absorption. It is difficult to determinate its quantitative with spectrographic method currently. We used inductively coupled plasma mass spectrometer (ICP-MS) to determin

13、ate the content of Gd in drugs. The content of Gd is 23.8%. Then we can know the content of Gd2-DTPA-bis(ALN). This method is highly sensitivity, easy to operation and so on. 3) The adsorption between new bone-targeted Contrast agent and hydroxyapatite. Hydroxyapatite is the main component of bone.

14、Gd2-DTPA-bis(ALN) had higher adsorption rate about 39.925%. However, Gd-DTPA had no almost. New bone-targeted contrast agent can target to bone in vivo. IV 4) Determination the relaxation rate of new bone-targeted contrast agent. Paramagnetic MRI contrast agent can increase the quality of magnetic r

15、esonance angiography. Experiments show that the relaxation rate of new bone-targeted contrast agent Gd2-DTPA-bis(ALN) is 3.806mmol-1.L.s-1. It is higher than Gd-DTPA, which is 2.718 mmol-1.L.s-1. The result proved that the MRI effect of Gd2-DTPA-bis(ALN) was higher than that of Gd-DTPA. 5) Acute tox

16、icity study on nude mice. Injection different dose of Gd2-DTPA-bis(ALN), we observed the toxicological effect. The median lethal dose (ID50) was 0.66 g/Kg, the zero lethal dose was 0.375mol/Kg， the 100% lethal was 3.0mol/Kg. 6) Bone targeting study of the new bone-targeted contrast agent in osteosar

17、coma cells. Gd2-DTPA-bis(ALN) has bis (phosphonic acid), which can affine to osteoclasts and osteoclasts. Osteosarcoma UMR106 as model, we determined the effect of Gd2-DTPA-bis(ALN) and Gd-DTPA to osteosarcoma. When the concentration of Gd2-DTPA-bis(ALN) is low of 10-5mol/L, it is no effect on osteo

18、sarcoma. When is 10-3mol/L, it can promoted proliferation. However, Gd-DTPA had no this function. 7) The studies of iconography of new bone-targeted contrast agents in osteosarcoma model. Through injecting the osteosarcoma UMR106 cells into proximal tibia and distal femur, we have established the os

19、teosarcoma model in BALB/C mice. And we evaluated the model by X radial. Gd2-DTPA-bis(ALN) was major in the great vessels at 0-5 min, in osteosarcoma at 25-50 min, in liver and kidney at 75 min. However, Gd-DTPA was major in the great vessels at 0-5 min, in the whole body after 5 min. Gd2-DTPA-bis(A

20、LN) showed higher MRI effect than Gd-DTPA. ICP-MS was used to determine Gd in vivo. The result above can provide that a novel bone-targeted contrast agent was prepared, which is V bone-targeted, higher relaxation, stability and safe. KEYWORDS: Bisphosphonic acid, Bone targeting, Gadolinium diethylen

21、etriamine triacetate, MRI contrast agent, Osteosarcoma VII 缩写表 缩写 英文原名 中文名称 ALN Alendronate sodium 阿仑膦酸钠 BP Bisphosphonate 偕二膦酸盐 CAs Contrast agents 造影剂 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲亚砜 DTPA Diethylenetriaminepentaacetic acid 二乙基三胺五乙酸 DMAP Dimethylaminopyridine 二甲氨基吡啶 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 HA Hydr

22、oxyapatite 羟基磷灰石 HR Hemolysis ratio 溶血率 ICP-MS Inductively coupled plasma-mass spectral instrument 电感耦合等离子体质谱仪 Gd-DTPA Gd2-diethylenetriaminepentaacetate 钆 -二乙基三胺五乙酸 Gd2-DTPA- bis(ALN) Gd2-diethylenetriaminepentaacetate bis(alendronate) 钆 -二乙基三胺五乙酸双阿仑膦酸钠 MRI Magnetic resonance imaging 磁共振成像 PBS Phos

23、phate buffered solution 磷酸缓冲盐 IX 目 录 摘 要 . I Abstract . III 缩写表 . VII 目 录 . IX 绪 论 . 1 1 骨肉瘤 . 1 2 骨靶向 . 2 3 造影剂 . 4 4 造影剂研究现状 . 7 5 本文设计思路 . 10 第一章 新型骨靶向磁共振成像造影剂的合成 . 13 1 材料与方法 . 13 2 结果与讨论 . 15 本章小结 . 21 第一节 新型磁共振成像造影剂中钆含量测定 . 23 1 材料与方法 . 23 2 结果与讨论 . 25 第二节 新型磁共振成像造影剂的酸解离常数 . 26 1 材料与方法 . 26 2

24、结果与讨论 . 27 第三节 新型磁共振成像造影剂的稳定常数 . 28 1 材料与方法 . 29 2 结果与讨论 . 31 本章小结 . 33 第三章 羟基磷灰石对磁共振成像造影剂的吸附作用 . 35 第一节 硫酸高铈法测定造影剂的含量 . 35 1 材料与方法 . 35 X 2 结果与讨论 . 37 第二节 新型骨靶向造影剂与羟基磷灰石吸附性评价 . 38 1 材料与方法 . 39 2 结果与讨论 . 40 本章小结 . 41 1 材料与方法 . 43 2 结果与讨论 . 44 本章小结 . 46 第五章 新型骨靶向造影剂的安全性评价 . 47 第一节 骨靶向造影剂的溶血性 . 47 1 材

25、料与方法 . 47 2 结果与讨论 . 48 第二节 骨靶向造影剂的小鼠急性毒性 . 49 1 材料与方法 . 49 2 结果与讨论 . 51 本章小结 . 54 第六章 新型骨靶向造影剂对成骨细胞生长的影响 . 55 第一节 骨肉瘤细胞的培养 . 55 1 材料与方法 . 55 2 结果与讨论 . 56 第二节 造影剂对细胞生长的影响 . 56 1 材料与方法 . 57 2 结果与讨论 . 58 第三节 造影剂对骨肉瘤细胞碱性磷酸酶活性的影响 . 61 1 材料与方法 . 62 2 结果与讨论 . 63 第四节 RT-PCR 法半定量检测 OPG/RANKL mRNA 表达 . 66 1 材料与方法 . 67 2 结果与讨论 . 68 XI 本章小结 . 70 第七章 新型骨靶向造影剂的动物磁共振成像 . 71 第一节 裸鼠骨肉瘤模型的建立和评价 . 71 1 材料与方法 . 71 2 结果与讨论 . 72 第二节 骨靶向造影剂的骨肉瘤模型裸鼠成像 . 75 1 材料与方法 . 75 2 结果与讨论 . 77 第三节 骨靶向磁共振造影剂在裸鼠骨肉瘤模型的体内分布 . 80 1 材料与方法 . 80 2 结果与讨论 . 80 本章小结 . 83 全文总结 . 85 创新点 . 87 不足之处与期望 . 87 参考文献 . 89 致 谢 . 95