1、第五章 目的基因的制备第一节 目的基因的制备第二节 目的基因的分离* 1一 概 述 基因工程或 DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。目的基因确定其表达调控机制和生物学功能建立高效表达系统构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）体外进行必要的结构功能修饰输回细胞内改良生物体遗传性状，包括人体基因治疗Date 2二 什么是目的基因 基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中 ， 创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中 ， 根据需要分离出此类基因 ，即准备要 分离、改造、扩增或表达 的基因 通常称之为 目的基因 。 如抗逆性相关基因（抗病
2、、抗寒等）、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因 、工业用酶等相关基因等。Date 3 一般来说，目的基因的制备战略分为 两大类 一类是构建感兴趣的生物个体的 基因文库 ，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用 PCR扩增 技术甚至 化学合成 法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。Date 4第一节 目的基因的制备 1、直接法制备基因 2、从基因组文库中钓取目的基因 3、从 cDNA文库中钓取目的基因 4、通过 PCR直接扩增出目的基因2019/8/8 5第一节 目的基因的制备1.1 限制性核酸内切酶酶切分离法 限
3、制性内切酶酶切分离法适于 从简单基因组 （如 质粒和病毒 ） 中分离目的基因。 对已定序的 DNA分子 ， 只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割 ， 分离纯化所需 DNA片段 ， 与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。 对已知定位的目的基因 ， 只要根据目的基因两侧的已知的限制性内切酶识别位点 ， 用适当的限制性内切酶切割 ， 一次就可获得目的基因。Date 6所谓 基因就是 具有特定生物学功能的一段核苷酸序列， 所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。1977年，利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现
4、了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。早期通过化学合成的部分基因基因人胰岛素转运 RNA-干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素-干扰素大小（ bp）12654281162453合成年代197819791981198219821984基因视紫红质前脑菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶 T1RNA酶大小（ bp）105777170385324375合成年代1985198519851985198619871.2 化学法直接合成基因Date 71.2.1.1小片段粘接法： 混合退火根据目的基因全序列，分别合成 12-15碱基长的单链 DNA小片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 1.2.1 化学合成法的基本战略全基因合成有三种战略：* 8混合退火T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合1.2.1.2 补钉延长法根据目的基因两条互补链全序列，分别合成 12-15碱基长的 单链DNA小片段以及 20-30碱基长的 单链 DNA中片段* 9根据目的基因 的 全序列，分别合成 40-50碱基长的单链DNA片段混合退火T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合1.2.1.3 大片段酶促法 * 10
