遗传性疾病的分子诊断-上海交通大学医学院医学检验系.ppt

1、分子诊断的临床应用,上海交通大学医学院樊绮诗 教授,用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。 上世纪70年代人们开始在实验室进行研究，80年代以来，基因检测在许多国家已成为常规检验项目，主要用于感染性和遗传性疾病等的诊断。,1953年Watson 和Crick 提出脱氧核糖核酸的双螺旋结构模型。1990年人类基因组计划正式启动。2001年2月科学家宣布完成人类基因组的全部序列图。,DNA重组技术(DNA recombination) 转基因技术(transgenic technique) 基因组学(genomics) 蛋白组学(pro

2、teomics) 基因治疗(genotherapy) 生物芯片(biochip)等技术 已应用到医学领域，对疾病机理的认识、疾病的诊断、预防和治疗产生了深刻的影响。,分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊 断，也能确定个体对疾病的易感性，判别 致病基因携带者并对疾病的分期、分型、 疗效监测和预后作出判断。分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组 成部分，成为一门新的学科。Molecular diagnosis Molecular diagnostics,一、基因检测在感染性疾病中的应用,SARS相关冠状病毒的分子诊断,2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50 例SARS病人的临床表现和病毒

3、学研究结果。一种新的冠状病毒 (Coronavirus) 是SARS 的致病原因。 (Lancet, 2003, 361: 9365),2003年4月，德国汉堡Bernhard-Nocht热带医学研究所学者Drosten等用随机扩增技术，获得一段长度为300bp的核苷酸序列。根据这段序列，建立了检测新冠状病毒的常规和实时定量PCR技术。 .org on April 10, 2003）,检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液 、血浆、粪便。检测方法 1. 逆转录-巢式PCR (Reverse-Nested PCR) 2. 逆转录-实时PCR (Reverse-Real time PCR

4、),有报道显示，在可能SARS病人中病毒的检出率为100%。在疑似SARS病人中的检出率为23%。所有健康接触者中未检测到病毒。,另一项研究显示 检测病毒的3种方法（血清学检测、病毒分离、PCR技术）中，PCR技术的检出率最高。,讨 论,疾病的早期即可获得阳性结果(早于血清转换期）。SARS患者中的阳性率约为80%，对照中的阴性率约为98%100%。现有的PCR方法有较高的特异性但灵敏度较差，阴性结果不能排除病毒感染。,讨 论,SARS相关冠状病毒基因检测必须注意的问题,必须在规范的基因扩增实验室中进行。应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。阳性结果时必须对原始样本重复检验： 或者扩增

5、另一个基因片段 或在另一个实验室对同一样本进行检测。,肝炎病毒基因的检测,临床价值主要体现在：病情评估 血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重。疗效预测 治疗前病毒核酸载量越高，疗效越差；载量越低，机体清除病毒的可能性越大。,预后判断病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。垂直传播途径感染者，预后较差。反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸 水平经常波动者更易发展为肝硬化。,病毒分型和耐药检测各个编码区段存在着大量有意义的自然变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异株，从而导致 HBV感染的不同血清学和临床表现。检测HBV的变异株对了解疾病机制、药物

6、耐受和指导用药有一定的价值。,HPV基因的检测在预防宫颈癌中的作用,宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，每年约有50万左右新发病例。我国每年有新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的26%。,持续的人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV) 感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素，93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到HPV DNA。高危型HPV-16和HPV-18分别占宫颈癌的50%和14%。高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风险增加250倍。,HPV DNA的检测方法实时定量PCR (Real time PCR)核酸杂交

7、捕获（Hybrid Capture，HC）,HC 可一次检测所有致癌的13种高危型HPV。敏感度：对CIN 、和癌的检出率为 98%。阴性预期值：对高度鳞状上皮细胞病变或更高度病变的阴性预期值99.9%,细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。细胞学检查+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。,基因检测在监测移植物排斥中的作用,关于多瘤病毒,人类多瘤病毒中常见的3种病毒：BK、JC、SV40。BK病毒于1971年首次从肾脏移植受体的尿液中分离出。病毒主要在宿主的细胞核内进行复制。,在美国，10岁以上的正常人群中

8、60%80%有BK病毒感染史。感染的病毒多潜伏于肾小管上皮细胞和尿道上皮细胞中。BK病毒重新激活大部分是由于免疫机制缺陷或大量使用免疫抑制剂后。,肾脏移植术后大量使用免疫抑制剂，使BK病毒重新激活，大量复制。BK病毒复制进一步发展，成为BK病毒感染的肾间质性肾病（BKVAN）。BKVAN患者中60%70%会发生远期的肾脏移植失败。,BK病毒感染已经成为肾脏移植远期失败的重要原因之一。BK病毒感染越来越受到关注。,早期无临床症状，后期症状与肾移植排斥和药物毒性反应相似，易引起误诊和漏诊。BK病毒感染和移植排斥治疗原则相反：BK病毒感染需要降低免疫抑制剂量，而移植排斥则应加大用量。,因此，建立有效

9、的BK病毒检测和监测体系是十分必要的。,decoy细胞BK病毒感染的肾脏小管上皮细胞脱落至尿液。形态学检测敏感性较好，但特异性差。细胞形态在尿液中很容易破坏。,巴氏染色的decoy细胞,未经染色的decoy 细胞,BK病毒感染的检测,BK病毒的检测血、尿中BK病毒核酸定量检测尿液中decoy细胞检查尿沉渣涂片原位杂交组织病理学检查（判断肾脏间质性肾病）,肾脏移植术后病人BK病毒检测的研究,对象瑞金医院肾脏移植术后2个月3年的患者95例正常人标本60例研究方法尿沉渣细胞形态学检测血、尿中BK 病毒DNA的定量检测,Decoy细胞形态学特征:小管上皮细胞的细胞核明显增大，多偏向一侧，核浆比例明显增

10、加；细胞边缘常常出现毛玻璃样改变；胞浆有细小颗粒，较均匀，呈果冻状；细胞核常较粗糙。,结 果,95例患者的尿沉渣形态学检查，35例患者的尿沉渣中出现可疑的病毒感染肾小管上皮细胞（decoy细胞）。,尿液中BK病毒核酸定量检测14例尿液中检测到BKV DNA，病毒载量为41032109/ml，平均为5.6105/ml。发生病毒尿的中位时间为移植术后14个月。,血浆中BK病毒核酸检测14例病毒尿中，有5例同时出现病毒血症。核酸载量为2104/ml4.8106/ml，平均为 4.2104/ml。,阴性对照,6例病毒检测阳性的核酸标本进行序列分析。 所测片段序列均为BK病毒的核酸序列,BK病毒核酸序列

11、,核酸序列分析,3例患者在临床上出现不明原因的发热、白细胞降低、缓慢的肌酐升高等症状，有1例甚至出现了尿道阻塞。临床上认为发生BKVAN的可能性较大，给予抗病毒治疗。,病例1、2,治疗前：尿液和血浆病毒核酸载量在104/ml105/ml血肌酐分别为181mol/L和168mol/L治疗后：血浆和尿液中BK病毒已检测不出血肌酐降为160mol/L和129mol/L,病例3,治疗前尿液中BK病毒核酸载量为2109拷贝/ml尿沉渣细胞中见到大量decoy细胞和炎性细胞治疗后尿液中BK病毒核酸载量降至105拷贝/ml尿沉渣细胞中decoy细胞明显减少,治疗前,治疗10天后,治疗20天后,讨 论,文献报

12、道BK病毒的复制感染率为5%60%，本研究中发生BK病毒复制的占14.7%。35例患者中发现decoy细胞，仅14例被证实存在病毒核酸，提示形态学检查特异性差。肾脏移植的患者容易导致包括BK病毒在内的多种病毒感染。,因此是否存在BK病毒感染，形态学仅作为筛查实验。病毒核酸定量可有效地动态观察病毒核酸的复制。,BK病毒核酸定量检测用于检测BK病毒是否复制为是否需要进行病理学检查提供依据监测疾病和评价治疗效果预防间质性肾病，防止移植远期失败,二、遗传性疾病的分子诊断,分子诊断能够检出家系中的致病基因携带者或高危个体，能够在胎儿出生前判断其是否为患者，因此分子诊断是降低单基因遗传病发病率的根本措施。

13、,单基因遗传病是由于某一基因结构的变化或基因表达异常而导致的疾病用分子生物学技术检测致病基因的遗传缺陷是诊断这类疾病最根本的手段,遗传性疾病中常见的分子异常,遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物蛋白质（或酶）的表现异常所致。基因突变主要包括点突变、片段性突变和动态性突变。,点突变 (point mutation),包括错义突变、无义突变、移码突变各种点突变所造成的后果： 蛋白质分子量改变 蛋白质合成量下降 无蛋白质合成,片段性突变(fragememtal mutation),核苷酸的丢失和增多缺失：基因中硷基（遗传

14、物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复基因重排：基因组中原来不在一起的基因由于某些原因组合排列在一起,动态性突变(dynamic mutation),以三核苷酸为单位的重复序列在传递过程中 不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往 往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。 脆性X综合征：CGG重复 少年脊髓型共济失调：GAA重复 亨廷顿病：CAG重复,X染色体（xq27.3）的脆性位点,脆性X综合征是遗传性智力缺陷最常见的一种。 致病基因FMR-1的5端有CGG三核苷酸重复区。 普通男性群体中的患病率为1/4000。 普通女性群体中的患病率为1/6000。

15、 患者智力低下、语言障碍、行为异常、呈特殊 面容。,正常个体：CGG重复次数652次，中国人群以(CGG)28为多见。前突变(premutation)： (CGG) 53230为携带者，虽表型正常，但在传 递过程中易发生进一步扩展，使后代的CGG重复次数大大增加，并 有异常表型。全突变： (CGG) 230时，100%的男性表现为典型的脆性X综合征, 53%的女性表现为程度不同的智力低下。,遗传性疾病基因诊断的策略,（一）直接诊断策略 基因诊断的直接策略是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。 直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比

16、较可靠。,DMD的基因检测,Duchenne muscular dystrophy (DMD) 是一种高发病率、高致残、高致死的X连锁的遗传性疾病，在3500个活产男婴中即有一个患者。 DMD基因的全长为250kb，有79个外显子。 DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占 60%70%。,DMD基因外显子的检测,（二）间接诊断策略,间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是否带有致病基因。 间接诊断不是寻找 DNA 的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估计被检者患病的可能性。,间接诊断：分析DNA的遗传标

17、记的多态性,双等位基因(bi-allele）多态性：限制性片段长度多态性（RFLP） 第一代DNA遗传标记，所含信息量有限。 检测技术：Southern印迹技术,多等位基因多态性(multi-allele),小卫星序列又称串联重复可变数目（variable number tandem repeats，VNTR）第二代DNA遗传标记以 670bp 为单位，以串联形式排列，构成数量可变的串联重复序列等位基因常常达10个以上，信息量比 RFLP大 检测技术：PCR,微卫星序列 (microsatellite)以 26bp 为单位，重复次数可达几十次，又称短串联重复序列(STR) 。在基因组中分布广泛

18、，出现的数目和频率不同，具高度多态性。 检测技术：PCR,单核苷酸多态性(single nucleotide poly- morphism，SNP),第三代DNA的遗传标记，其多态性仅表现为 单个核苷酸的变异。在人类基因组中的数目可达300万个，是一种信息量非常大的标记系统。 检测技术：DNA芯片技术,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,C50: C49: C45: C44: Cjp:,12212,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C

19、49: C45: C44: Cjp:,21121,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,凝血因子(F8)基因的主要遗传缺陷,点突变(point mutation) 缺失(deletio

20、n)倒位(invertion)：发生于第22号内含子，可在40%-50%重型HA中检测到,间接诊断的不确定性,遗传标记所带的信息性有限新突变基因重组家系成员不完整,三、基因检测在多基因病中的应用,多基因病具一定的遗传因素，家庭发病率高于人群发病率，但是疾病的产生都以一定的环境条件为诱因，遗传因素在其中所起作用程度各异。,多基因病中的遗传因素是若干个易感基因微小作用的累加，某一易感基因结构的变化不足以导致疾病的产生。,人类基因组多态性是多基因病基因诊断的基础，易感基因多态性的检测能帮助我们理解多基因病发生的机制，有助于对疾病的诊断和分类。,高血压候选基因多态性分析在EH中的应用前景,临床分型 靶

21、器官损伤研究 个体化治疗,基因多态性与盐敏感性高血压,-内收素血管紧张素转换酶上皮钠通道血管紧张素原心钠素 2肾上腺素能受体 SA G蛋白亚单位3,基因多态性与高血压靶器官损伤,脑卒中 载脂蛋白E -纤维蛋白原 血管紧张素原 血管紧张素II的1型受体 内皮型一氧化氮合酶 心钠素,冠心病 副氧酶 凝血因子V 凝血因子VII 载脂蛋白B,ACE基因多态性与高血压靶器官损伤,疾病 研究报告数 I D DD冠心病 30 + 11 % + 32 % 心肌梗死 15 + 12 % + 39 %脑卒中 5 + 22 % + 94 %高血压肾病 19 + 10 % + 53 %糖尿病肾病 11 + 40 %

22、+ 56 % * 与II型相比，DD型和ID型发生上述疾病的危险性增高程度 (ACE基因I/D多态性研究49959例的荟萃分析）,ACE基因多态性：16号内含子有一Alu重复序列，为插入/缺失多态性，构成II、ID、DD三种基因型,基因多态性检测与个体化治疗,人类基因组计划已经完成，功能基因组研究正在实施。 有朝一日，临床医师能根据病人易感基因的多态性设计有效的、个体化的治疗方案，以达到最佳治疗效果。,ATG基因多态性研究,目的：观察ATG基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的 血压变化和高血压发病率间的关系对象：1509例基因分析：ATG基因G-A多态性结果：三年后高血压发生率（%） 对照组 限

23、盐组 减轻体重组 AA型 45 28 25 GG型 32 41 32 Hunt SC,et al: Hypertension, 1998;32:393-401,基因多态性分析指导抗高血压药物的选择,药物种类 基因 利尿剂-内收素 ACE抑制剂ACE、AT1-受体阻滞剂G蛋白（Gs),四、肿瘤相关基因检测在肿瘤病情监测中的应用,肿瘤是由于遗传物质（肿瘤相关基因）发生突变而导致的疾病。肿瘤相关基因的突变只是增加了个体对肿瘤的易感性而并不一定马上产生肿瘤，肿瘤的发生是一个多因素、多步骤打击的过程。,实时定量RT-PCR技术在急性早幼粒细胞白血病中的应用,PML-RAR融合基因是 APL特异的分子标志

24、,初发APL的PML-RAR融合基因的拷贝数均大于1000。经全反式维甲酸、ATRA +化疗、三氧化二砷 治疗获得缓解后，其PML-RAR融合基因的拷 贝数明显降低，并随着巩固治疗的进行而进一步降低。,长期无病生存的患者的PML-RAR融合基因的拷贝数均长期低于200一旦患者的检测值高于该值，则强烈提示复发的可能,APL完全缓解和复发时PML-RAR融合基因的检测,CEA基因的定量检测在监测胃肠癌微转移中的应用,CEA基因在消化系统上皮腺癌，尤其是直结肠癌和胃癌中高表达，而在正常成人体内极少表达。,正常人外周血CEA基因表达情况,在肿瘤发生血道转移时，外周血中有少量肿瘤细胞残留。在肿瘤细胞内可检测到CEA基因的转录本。,胃肠癌组织中CEA基因的表达,胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达,用灵敏、特异的荧光定量PCR技术检测到这些肿瘤细胞中CEA基因的转录本，是发现肿瘤早期转移的关键。,