第十章甾体激素类药物的分析.ppt

1、第十三章 生物制品分析概论,第一节 概 述,药物的三大类:,一、生化药物与基因工程药物的定义,生化药物: 一般系指以下三种途径获得的药物：其一，从 动物、植物及微生物分离纯化；其二、生物 化学半合成；其三，现代生物技术制取。该类 药物主要包括：生命基本物质及其衍生物、降 解物、大分子结构修饰物等。,例： 氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、核苷酸和脂等。,续定义,基因工程药物: 在确定了对某种疾病具有预防和治疗作用 的蛋白质的基础上,分离、纯化或人工合 成控制该蛋白质合成的基因，并利用重组 DNA技术进行改造，最后将该基因导入可 以大量生产的受体细胞中进行繁殖或表达 ，从而大规模生产出具有预

2、防和治疗疾病 作用的药用蛋白质。,二、生化药物与基因工程药物的种类,（一）生化药物的种类,种类（续）,氨基酸及其衍生物类药物1、单氨基酸例如：亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、色氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、苏氨酸等等。2、氨基酸衍生物例如：N-乙酰上-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸乙酯盐酸盐、S氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸等等。3、复合氨基酸注射液例如：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S复合氨基酸注射液。S代表氨基酸的种类。,种类（续）,药用活性多肽1、垂体多肽：例如： 促胃液素(5肽)、催产素(9肽)等。2、消

3、化道多肽：例如：胃泌素(14肽，17肽和34肽三种)3、下丘脑多肽：例：促甲状腺素释放激素(3肽) 。4、脑多肽：例：新啡肽(25肽)，-内啡肽(3l肽)等。5、激肽类：例：血管紧张肽I(10肽)、(8肽)、(7肽 )等活性肽。6、其它肽类：例：谷胱甘肽(3肽)、1胸腺素(28肽) 。,种类（续）,药物蛋白质1、蛋白激素类药物：例如：胰岛素、生长激素 、催产素。2、天然蛋白质类药物：例如：血清白蛋白、干 扰素。3、蛋白质类药物制剂：例如：明胶海绵、氧化 聚明胶。,种类（续）,酶与辅酶类药物1、助消化酶类：例：胃蛋白酶、胰酶、胰脂肪酶。2、蛋白水解酶类：例：溶菌酶、胰DNA酶、胶原蛋白酶。3、凝

4、血酶及抗栓酶：例：牛凝血酶、纤溶酶、尿激酶。4、抗肿瘤酶：例：L-天门冬酰胺酶、组氨酸酶、精氨酸 酶。5、其它酶类：例：超氧化物歧化酶(SOD)、RNA酶、DNA酶 、青霉素酶。6、辅酶类药物：辅酶对酶的催化反应起着促进作用。 例：辅酶、辅酶、辅酶A、辅酶Q10、黄素单核苷酸。,种类（续）,多糖类药物该类药物来源广泛，以黏多糖为主，其特点为：（1）、由糖苷键将单糖连接而成多糖。（2）、因单糖结构糖苷键位置不同，使多糖种类繁多， 药理功能各异。如抗凝、降血脂、抗病毒、抗肿 瘤、增强免疫功能和抗衰老等多方面的生理活性。,例如：肝素、硫酸软骨素A和C、刺参多糖、银耳多糖、 人胎盘脂多糖、壳聚多糖。,

5、种类（续）,脂质类药物1、磷脂：如脑磷脂、卵磷脂。2、降血脂：如天然亚油酸、亚麻酸、多价不饱和脂肪酸 （PUFA）、前列腺素PGE1、PGE2、PGF2a、 PGI2。3、胆酸：如去氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸。4、固醇：如胆固醇、麦角固醇、-谷固醇。5、卟啉：如血红素、胆红素、原卟啉。,种类（续）,核酸及其降解物和衍生物类药物1、核酸：例如，从小牛胸腺或鱼精中提取的DNA可用于 治疗精神迟缓、虚弱和抗辐射。2、多聚核苷酸：例如，多聚胞苷酸、聚肌苷酸等是干扰素 的诱导剂，用于抗病毒、抗肿瘤。3、核苷、核苷酸及其衍生物：例，ATP、cAMP、CDP-胆 碱、AMP、肌苷等。也可将它们进行化学修

6、饰 后用于治疗肿瘤和病毒感染。治疗肿瘤的如6-巯 基嘌呤、2-脱氧核苷。抗病毒的如，环胞苷、 5-碘苷。,（二）、基因工程类药物的种类,三、生化药物与基因工程药物的特点,1、共同特点： 均来自生物体,是生物体的基本生化成分,具有生物活性或生理功能,对疾病具有针对性强、毒副作用小、易于人体吸收。,2、分子量大且不是定值 小部分药物（如：氨基酸、辅酶）属化学结构明确的小分子化合物，大部分为大分子的物质(如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等)，其分子量一般几千至几十万。对大分子的生化药物而言，即使组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的生理活性。所以，生化药物常需进行分子量的测定。,特点（续）,3结构确证

7、难 由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用元素分析、红外、紫外、核磁、质谱等方法加以证实，往往还要用生化法如氨基酸序列等法加以证实。,4、全过程质量控制 该类药物对热、酸、碱、重金属等均较敏感，往往需要对原料药、生产过程和产品进行全过程质量控制，且要求比其它药物更为严格。,5需检查生物活性 在制备多肽或蛋白质类药物时，有时因工艺条件的变化，导致蛋白质失活。因此，对这些生化药物，除了用通常采用的理化法检验外。尚需用生物检定法进行检定，以证实其生物活性。,特点（续）,6需做安全性检查由于生化药物的性质特殊。生产工艺复杂，易引入特殊杂质。故生化药物常需做安全性检查，如热原检查、过敏试验、异

8、常毒性试验等。,7需做效价测定 该类药物多数可通过含量测定，以表明其主药的含量。但对酶类药物需进行效价测定或酶活力测定，以表明其有效成分含量的高低。,第二节 质量检验的基本程序与方法,一、鉴别试验,真伪鉴别方法,化学药物:化学方法、物理学方法,生化药物与基因工程药物:化学方法、物理学方法、生 物学方法。且需要标准品或 对照品进行对照实验。,（一）、理化鉴别,1、化学鉴别法 利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。,例如，溶菌酶的鉴别采用呈色法：溶茵酶分子中的四个肽键上的氮原子能与铜离子(Cu2+)络合，生成有颜色的络合物，肽键越多，产生的颜色越深。,理化鉴别(续),2

9、、紫外分光光度法 由于很多生物大分子均有共轭系统,可产生特征可见紫外吸收，使较多药物能够用紫外分光光度法的特征吸收进行鉴别。,例如， 0.0lmol/L的三磷酸腺苷二钠的盐酸水溶液在257nm的波长处有最大吸收。用A250nm/A260nm的值0.17-0.27进行鉴别。,理化鉴别(续),3、高效液相色谱法 利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。,例如， 重组人生长激素的鉴别： 1）供试品与对照品的主峰保留时间一致。 2）供试品与对照品的肽图谱保持一致性。,（二）、生化鉴别,1、酶法 由于酶催化化学反应的高度专一性，利用特定的酶仅能催化特定的化学反应，可以有效地鉴

10、别该药物。,例如，尿激酶是专属性较强的蛋白水解酶，根据尿激 酶能激活牛纤维蛋白溶酶原而具有相同作用的 链激酶不能激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别， 并用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作 为判断指标。,生化鉴别(续),2、电泳法 基于生物大分子分子量的较大差异和荷电的差异，在电泳法中具有不同的迁移距离，从而鉴别生化药物。,例如，肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素是由D-硫 酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘 多糖，其水溶液带强负电荷，于琼脂凝胶板上， 在电场作用下，向正极方向移动，与肝素国家标 准品对照，其移动位置应对应。,生化鉴别(续),3、样品脱盐后用等电点聚焦法测定 基因工程药物

11、往往有多个等电点，利用等电点聚焦从而形成多个区带，基于该区带的一致性鉴别药物。,（三）生物鉴别法 利用生物体进行试验来鉴别药物。,例如，用家兔惊厥试验来鉴别胰岛素，它是通过胰岛素的降血糖作用进行鉴别的。当剂量过大，血糖降低至一定水平(约30)，家兔即发生惊厥，迅速静注50葡萄糖注射液，补充血糖、惊厥停止，说明惊厥是胰岛素所致低血糖而引起的。, 生物药物鉴别应该注意以下三点：,（1）药物的取样：由于生物药物多数为大分子药物，有的化学结构不明确，有的分子量不是定值，使质量控制较为困难。在大量的样品中取少量供试品进行分析，应考虑取样的科学性、真实性和代表性，其基本原则是均匀、合理。,（2）鉴别结果评

12、价：由于生化药物的复杂性和不确定性，通常鉴别不是由一项试验完成，而是采用一组试验项目综合评价一种药物。,（3）目前仍存在相当一部分生化药物没有找到有效的鉴别方法。,二、杂质检查,1、一般杂质检查 生化药物的一般杂质检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。其检查的原理及方法与化学药物中的一般杂质检查相同。,杂质检查（续）,2特殊杂质检查 特殊杂质主要是指从生产工艺中引入或原料中带入的杂质。许多生化药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药物中易残存一些杂质或其他成分。,例如，胰蛋白酶是从动物胰中提取制得的一种蛋白水

13、解酶，在制备过程中，易带入杂质糜蛋白酶，根据 糜蛋白酶的特性可以选用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯为 底物作糜蛋白酶的限度检查。,三、安全性检查,（一）、热原检查和细菌内毒素检查 详见第十二章药物制剂分析（P302-303）,（二）、异常毒性试验 异常毒性试验是用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反应。反应的判断以试验动物死亡与否为终点。,安全性检查（续）,中国药典规定的异常毒性试验，实际上是一个限度试验。在此剂量条件下，一般供试品不应使试验动物中毒致死；如果出现试验动物急性中毒而死亡，则反映该供试品中含有的急性毒性物质超过了正常水平，因此，本试验又称

14、异常毒性检查法。,试验动物：小白鼠。试验方法：尾静脉注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口 服给药法。,安全性检查（续）,例如，玻璃酸酶的异常毒性检查方法如：取体重17 22g的健康小白鼠5只，分别由皮下注射每1ml中含玻 璃酸酶10000单位的氯化钠注射液0.25ml，48h内不得 发生皮下组织坏死或死亡如有一只小白鼠发生组织 坏死或死亡，应按上述方法复试，全部小白鼠在48h 内不得有组织坏死或死亡现象。,安全性检查（续）,(三)、过敏试验 过敏试验是检查异性蛋白的试验。,试验动物：豚鼠。试验方法：皮肤过敏试验、腹腔注射试验。,原因：药物中夹杂有异性蛋白，在临床使用时易引起病人 多种过敏反应（如

15、，皮肤红斑、血压下降、休克和 死亡等）。因此，有可能存在异性蛋白的药物、应 作过敏试验。,安全性检查（续）,例如，蛋白制剂细胞色素C在制备中可能掺入杂蛋白，中国药典规定该溶液及注射液应做过敏试验。,方法：取本品适量，加灭菌注射用水稀释成每lml中含细胞色素C 7.5mg的溶液，作为致敏液与供试品溶液。另取体重为250350g的健康豚鼠6只，连续3次隔日腹腔注射致敏液0.5ml， 2周后，再自股(耳)静脉注射供试品溶液lml，注射后15min内，均不得出现过敏性反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽三声等现象中的两种或两种以上者，或有抽搐、虚脱或死亡等现象之一者，应判为阳性。,安全性检查（续

16、）,(四)、降压物质检查法 降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。,试验动物：猫(或狗) 。试验方法：血压法检查药物中所含的降压物质 。,杂质的来源:在用动物脏器或组织为原料制备生化药物的过程中，正常组织内存在的组胺及部分氨甚酸脱羧形成的组胺、酪胺等胺类物质，均为这类杂质的来源。,安全性检查（续）,(五)、无菌试验 无菌试验是检查药品及敷料是否染有活菌的一种方法，是药典中较重要的检查项目之一。,原因:由于许多生化药物是在无茵条件下制备的，且不能高温灭菌。因此，无菌检查就更有必要。中国药典中几乎所有的注射用药均做无菌检查。,安全性检查（续）,

17、无菌试验的基本步骤a)、制备培养基： 为细菌生长、繁殖提供所必需的营 养物质碳源、氮源、维生素、矿物质等。b)、选择对照用菌液：供对照试验用。c)、具体检查：如接种、培养等操作。 d)、结果判断：得出阴性或阳性的结论。,安全性检查（续）,(六)、基因工程药物中可能杂质与污染物检查,可能杂质:残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素、蛋白质突 变体、蛋白质裂解物等。,主要污染物:微生物、热原、病毒等。,主要检查项目: 1）外源性DNA 2）宿主细胞蛋白质 3）细菌内毒素 4）其它有关杂质,安全性检查（续）,(七)、致突变试验 致突变试验一般包括：微生物回复突变试验、哺乳动 物培养细胞染色体畸变试验、啮

18、齿动物微核试 验、微生物电极法的致突变试验。,(八)、生殖毒性试验 生殖毒性试验一般包括：一般生殖毒性试验、致畸敏感 期毒性试验、围生期毒性试验。,四、含量（效价）测定,含量表示方法：通常有以下两种方法 1）百分含量表示。适用于结构明确的小分子药物或经 水解后变成小分子的药物。 2）生物效价或酶活力单位表示。适用于酶类、蛋白质 类等药物。,第三节 常用定量分析方法与应用,定量分析方法 生化药物和基因工程药物常用的定量分析方法包括以下四类：,定量分析方法（续）,3）生物检定法：以药物对生物体的作用效果为依据， 从而测定效价或活性。,定量分析方法（续）,一、理化分析法,（一）、化学分析法,基本原理

19、： 基于分析组分的化学、物理性质，将其溶解、挥发或转化为易于与体系分离的纯物质，再对其进行质量测定，从而获得所分析样品中被测组分的含量。,1、重量法,理化分析法（续）,常用方法：,理化分析法（续）,2、滴定法,常用方法： 酸碱滴定法、氧化还原滴定法、络合滴定法。, 基本原理： 若样品中被测组分与标准滴定液能够定量地、快速地发生化学反应，且该反应具有较强的选择性和适当的终点指示方法，我们将可以利用该滴定反应测定相应的化学组分。,理化分析法（续）,(二)、电化学分析法,常用方法： 离子选择性电极分析法、化学生物传感器分析法、极谱分析法、微电流电位法。, 基本原理： 当表面涂有敏感物质的电极与被测药

20、物接触时,将发生电化学反应产生具有一定特征的电信号。电化学分析将利用该电信号与药物浓度成比例的关系进行药物定量分析。,理化分析法（续）,(三)、光谱分析法,1、比色法 样品中被测组分在可见紫外光区没有明显的特征吸收，但它能够与显色剂发生显色反应，生成在可见光区具有明显特征吸收的有色物质。基于该特征吸收的强弱，从而定量测定样品中的被测组分。,2、紫外分光光度法 若样品中被测组分或被测组分转化后的产物在紫外光区具有明显的特征吸收，基于该吸收分析测定被测组分。,理化分析法（续）,比色法与紫外分光光度法的比较： 实际上，它们均是相同一类分析方法。通常比色法要进行衍生化，产生在可见光区有明显吸收的有色物

21、质，而紫外光谱法通常不需要衍生化，若衍生化，也只是产生在紫外光区有明显吸收的物质。,理化分析法（续）,例如：粘多糖硫酸软骨素的比色法测定、蛋白质和糜蛋白 酶的分光光度法测定,理化分析法（续）,3、荧光分光光度法 具有共轭大环的分子均能产生特征荧光光谱，利用荧光强度与浓度的比例关系对生物大分子进行定量分析。 由于很多生物大分子均有荧光吸收，因此荧光分光光度法是该类物质非常重要的一种定量分析方法。,理化分析法（续）,(四)、色谱分析法,1、高效液相色谱（High Performance Liquid Chromato- graphy i.e. HPLC）,在生化药物分析中，常用的HPLC有三种：

22、a）反相高效液相色谱（reversed phase HPLC i.e. RP-HPLC） b) 高效离子交换色谱(High Performance Ion Exchange Chromatography i.e. HPIEC) c)高效凝胶过滤色谱(High Performance Gel Filtration Chromatography i.e. HPGFC).,理化分析法（续）,(1)、反相高效液相色谱（RP-HPLC） 特 点 可以总结为以下5个方面:a）固定相：柱填料为C4、C8和C18烷基硅烷键合相。这些直链饱和烷烃是通过共价结合到硅胶载体上。最常用的为C18烷基键合相，即ODS。

23、b）流动相: 为极性二元或三元组合溶剂，常用的为甲醇水，乙腈水，或甲醇、乙腈分别与缓冲液构成的多元组合溶剂。,理化分析法（续）,c）样品中极性大的组分先洗脱出柱，极性小的组分后流出色谱柱。d）键合固定相不易被极性流动相洗脱，同时，由于固定相的非极性和强的化学惰性，使样品易于洗脱，保持了色谱柱的可逆性和长寿命。e)易于程序化改变流动相的组分浓度，即梯度洗脱法，从而分析组分性质相差较大的复杂体系。,理化分析法（续）,示例：基因工程药物生白能的含量测定, 固定相：ODS120T 流动相：A液：三氟乙酸水（0.1%） B液：三氟乙酸水溶液（1%）乙腈（90：10） 缓冲液: pH=7.0的磷酸缓冲液洗

24、脱方式: 梯度洗脱，其程序为：,理化分析法（续）, 定量方法：外标法、 其外标物为对照品。 tR =21.236min 为主成分生白能； tR =13.639min 为添加剂人血白蛋白。,理化分析法（续）,(2)、高效离子交换色谱（HPIEC） 基本原理 离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团和可交换离子基团，当流动相带着已电离化的组分通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，在流动过程中不断发生可逆交换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。, 特 点 可以归纳为以下4个方面: a）可在所有的PH值范围内使用。对于广泛选择各种缓冲液洗脱体系更为有利

25、。,理化分析法（续）,b) 填料的使用寿命长，易于可逆再生。有效防止了污染柱的性能下降或报废。,c) 很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性较为有利。基于此原因，离子色谱广泛应用于分离或分析可离解的生物化合物，如氨基酸、多肽、核酸、核苷和各种碱基以及蛋白质。,d) 流动相多为水溶液。在以水为流动相的离子交换色谱中，组分的保留值和分离度主要通过控制流动相的PH值和离子强度来调节。组分的分离是采用盐浓度增大的梯度洗脱方法。,理化分析法（续）,(3)、高效凝胶过滤色谱（HPGFC） 基本原理 固定相为多孔性凝胶，流动相为缓冲水溶液。被分离的样品组分分子依据其大小（或分子量）不同渗入凝胶孔的深度不同

26、，洗脱的难易程度也不同，从而按组分的分子大小（或分子量）分布而分离测定。, 特 点 a）组分的保留时间分布由组分分子大小分布决定。体积越小的组分分子，渗入凝胶孔越深，洗脱越困难，因此，大分子优先于小分子被洗脱。,理化分析法（续）,b）流动相为固定比例的缓冲水溶液。有时加入少量的能与水互溶的有机改性剂或表面活性剂。,c）活性蛋白质可以回收。,d）HPGFC广泛应用于生物药物大分子的分子量分布测定。它是测定蛋白质分子量的一种重要方法。,理化分析法（续）,2、灌注色谱（Perfusion Chromatography）,基本原理 灌注色谱的分离介质为高度交联的具有大孔结构的高分子物质,它具有8015

27、0nm的大扩散孔和600800nm的贯穿孔。流动相流经介质时，存在两种方式：一种，在浅表面的大扩散孔中的扩散作用，另一种为直接通过内表面的贯穿孔而流动。由于贯穿孔的大孔径使后者为主要的分离方式。分子结构和大小的不同使其与内表面孔的相互作用存在差异，从而达到分离测定的目的。,理化分析法（续）, 特 点 a）分离柱内表面积大量增加,使柱容量增大、分辨率提高。,b）流动相流速的增加对柱效的影响极小,因此生物大分子可以实现快速分离纯化与测定。,c）由于柱效高、分离时间短和生物活性降低少，因此，灌注色谱主要用于基因工程药物和其它大分子药物的分离纯化与分析。,二、酶 法,（1）分析原理是以酶催化某化学反应

28、为基础，通过对酶促反应速度的测定或对生成物浓度的测定而检测相应物质含量。,酶是具有专一性催化功能的蛋白质。利用酶的特性测定药物的含量，与其他分析方法相比有许多独特的特点，具体体现在以下六个方面：,（2）测定方法具有很强的专一性，常用于复杂组分中结构和物理化学性质比较相近的同类物质的分析鉴定。,酶法（续）,（3）样品一般不需要很复杂的预处理，操作简单。,（4）样品和试剂用量少，测定快速准确、灵敏度高。,（5）反应条件温和，一般不需要强酸强碱。,（6）酶不易于保存，结构很不稳定，易于受外界条件的影响而发生结构改变或变性而引起酶失活。, 在实际分析中，影响酶应用的两个最显著的因素为“强的专属性”和“

29、不稳定性”。,酶法（续）,（一）、酶活力测定法,1、基本概念,酶的活性单位(国际单位IU) 在25下，以最适的底物浓度、最适的缓冲液离子强度以及最适的pH值诸条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。酶的比活性即定为一毫克酶的活性单位。,酶活力（酶活性） 酶活力是指酶催化某化学反应的能力，其表征指标为酶催化该化学反应的速度。而速度用单位时间内反应底物的减少或产物的增加量来确定。分析对象是作为药物的酶。,酶法（续）,a）终点法：在适当条件下，把酶和底物混合，测定生成一定量产物所需的时间。,b）反应速率法：该类方法是通过测定酶促反应的速率从而表征酶活力，有两种方法实现该速率的测定。

30、其一、间断一定时间或连续测定反应指示量（如吸光度）的变化；其二、反应间隔一定时间，停止反应，测定底物减少或产物增加的量。,酶活力测定的常用方法,酶法（续）,2、酶促反应的条件及影响因素,酶促反应的动力学，满足于Michaelie-Menten方程（米氏方程），其表达式为：,其中，在一定底物浓度S时反应的速率； Km米氏常数； 在底物饱和时的最大反应速率。基于该方程，可以确定酶促反应速率与底物浓度S之间的定量关系。,酶法（续）, 条件选择的基本要求为： 所有待测定的酶分子都应该能够正常地发挥它的作用。即，反应系统中除了待测定的酶浓度是影响速度的唯一因素外，其它因素都处于最适于酶发挥催化作用的水平

31、。,由于酶的不稳定性，易于失活，因此，反应条件的选择就显得极其重要，主要的影响因素是底物、温度和PH值。,酶法（续）,（1）、底物a）、底物的性质应在物理化学性质上与产物不同，以便于产物的测定。b）、底物的浓度应足够的高。将使酶反应的速度不受其影响。此时，反应速率仅与酶量成正比，从而由速率测定确定酶含量。一般选择S=100Km。 c）、大多数酶具有相对专一性，在可被酶作用的各种底物中一般选择Km小的底物，这样可以减少酶的用量。,基于酶促反应条件选择的基本要求，主要考虑的影响因素有以下几方面：,酶法（续）,（2）溶液PH 溶液PH对酶促反应将产生严重的影响，在测定时，不但要选择适宜的反应PH，而

32、且要将反应维持在该PH值。其影响主要表现在以下几方面： a）它可能改变酶的活性中心的解离状况，升高或降低酶的活性； b）可能破坏酶的结构与构象导致酶失效； c）可能作用于反应系统的其它组成成分，从而影响酶反应，甚至改变可逆反应进行的方向。,酶法（续）,（3）温度 酶反应对温度十分敏感，因为温度能直接影响化学反应速度本身，也能影响酶的稳定性，还可能影响酶的构象和酶的催化机制。一般而言，温度变化1，酶反应速度可能相差5左右。因此，实验中温度变动应控制在0.1以内。酶反应温度通常选用25、30或37。,（4）、辅助因子 有些酶需要金属离子，有些酶则需要相应的辅酶物质。为了提高酶在反应系统中的稳定性，

33、有些也需要某些相应的物质。,酶法（续）,（5）、空白和对照实验 空白实验用于消除背景，噪音和其它一些未知影响因素对测定结果的影响。该实验可通过不加酶、或不加底物，或二者都加(但酶需预先经过失效处理)来实现。 对照实验：在浓度与测定量之间无准确的关系，或计量关系易受条件影响时，通常用纯酶或标准酶制剂进行测定，从而确定浓度与测定量之间的计量关系。,酶法（续）,3、测定方法,测定方法按取样和检测方式可分为取样测定法和连续测定法。,（1）取样测定法 在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反应后，再根据产物和底物在化学性质上的差别，选用适当的检测方法进行定量分析，

34、求得单位时间内酶促反应变化量的方法,即为取样测定法。,酶法（续）,a）加入酶的变性剂，使其酶失去专一性的催化活性。,b）由于酶对温度极为敏感，往往可以采用加热使酶失活，从而停止反应。, 停止酶促反应的常用方法：,c）基于酶促反应对溶液PH较敏感，若反应必须在适当的PH范围，否则反应将停止，且无其它副反应时，就可以采用改变PH的办法终止反应。,酶法（续）,例如，三氯醋酸是一种高效专一的蛋白质变性剂和沉淀剂，其缺点是在紫外光区有吸收. 高氯酸没有上述缺点，并且用氢氧化钾中和、冷却后，KCIO4还可沉淀除去，但它不适于对酸和氧化剂敏感的测定对象。,酶法（续）,（2）连续测定法 根据底物与产物在物理化

35、学性质方面的差异，在反应过程中实时、在线测定底物或产物的变化量,即为连续测定法。,特 点,a)准确性和测定效率均高于取样测定法。,b)对检测技术和实验仪器均要求较高，既要求检测要快速，又要求准确性和灵敏度要高，有时甚至要时间分辨。,c)实时在线检测是当今分析检测技术发展的方向，因此连续测定法为当前重要的检测技术。,酶法（续）,（3）检测方法,酶法（续）,4、反应速度的测定与要求,酶活力测定的目的，就是要通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量，因此，测定的要求即为反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系。反应速率的测定是通过 “酶反应进程曲线”而实现，其曲线的钭率即为酶反应速率。,酶反应进程曲线

36、和酶浓度曲线的特点,仅在反应的初始阶段，反应速度与酶浓度间才会出现良好的线性关系，该线性关系才能应用于酶浓度测定，该反应体系才是该酶浓度测定的适宜体系。,酶法（续）,酶法（续）,a) 制备两条曲线：酶反应进程曲线和酶浓度曲线。从前者求得反应初速度，根据初速度绘制酶浓度曲线，并通过后者来检验酶反应测定系统是否适宜。,c)在较多的时候，初始进程曲线并不是明显的直线，此时曲线的初始钭率即为酶的活性。此时，反应时间的测定也就要尽可能准确。,酶浓度测定的具有要求,b)初始测定点（包括零时点）应尽可能多（至少3-5个点），以保证在较低的产物浓度时准确测定酶的活性。,酶法（续）,（二）、酶分析法 酶分析法是

37、一种以酶为分析工具的分析方法，分析对象即为与酶反应有关的非酶物质。, 分析对象：底物、辅酶、酶活化剂、酶抑制剂。, 分析方法 a)动力学分析法：可以应用于底物、辅酶、酶活化剂、 酶抑制剂。 b)总变量分析法：实际上，即就是终点法，或者称为平 衡法，该方法仅能应用于底物浓度的测定。, 校正曲线：上述两类方法测定浓度均需使用校正曲线。,酶法（续）, 基本原理 选择适宜的反应控制条件，使被测物（底物、辅酶、活化剂、抑制剂等其中之一）的浓度为影响酶促反应速率的唯一因素，此时酶反应速度仅与被测物浓度存在确定的比例关系，通过测定该反应速度就可确定被测物的浓度。,1、动力学分析法,酶法（续）,注 意,a）动

38、力学分析中通常使被测物以外的其它组分处于恒定和最适。上述的“唯一因素”，在实际应用中，往往很难达到要求，仅能使其它影响因素尽可能减小，使被测物浓度成为影响酶促反应速度的主要因素。,b) 校正系统与测定系统应完全相同。在测定未知样品时，所采用的反应、测定系统和制备标准校正曲线时所用的系统应完全相同，而且待测样品的浓度还应控制在这一曲线范围以内。,酶法（续）, 动力学测定法的四种测定系统,a）被测物是酶的底物,从米氏方程可知，当底物浓度S Km时，酶反应速度与底物浓度成正比，即kS，酶反应相对底物而言为一级反应，因此测定酶反应速度可以得知其浓度。,b）被测物是辅酶,需要辅酶(NAD)、辅酶 (NA

39、DP)、辅酶A(CoA)之类辅酶的反应可看作是双底物反应。当另一类底物浓度足够高时，反应变为单底物反应, 反应速度将与辅酶浓度成正比。,酶法（续）,示 例 :以CoA的测定为例,基于它是酮戊二酸脱氢酶的辅酶的特点,即,-酮戊二酸 + CoA + NAD+ 琥珀酰-CoA + NADH + CO2,当底物-酮戊二酸和NAD处于足够高的浓度时，反应速度与CoA的浓度成正比。此反应可通过NADH在340nm处特征峰吸收度的变化来测定。,酶法（续）,c）被测物为活化剂,当其他条件最适且一定时，活化剂在低浓度范围内，酶反应速度随活化剂浓度增大而升高，并在一定范围内具有线性比例关系。,用动力学方法测定时应

40、注意两个问题,、活化剂浓度超过一定水平后常导致抑制.,、对于某一种酶，相似的离子往往也能表现出活化作用，因此测定不专一，易受到干扰。,酶法（续）,d）被测物是抑制剂,不可逆抑制剂对酶反应产生的抑制程度随抑制剂浓度呈线性增加，而且酶反应的最终抑制程度由抑制剂的绝对量决定.,不可逆抑制剂,可逆抑制剂在底物浓度一定时，在低的抑制剂浓度范围内，酶反应速度随抑制剂浓度升高呈线性降低。,可逆抑制剂,酶法（续）, 基本原理 根据被测物质的性质，选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用，然后在反应完成后，借助物理化学方法测出其总变化量，并参考反应的平衡点，计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。仅适用于底物的

41、测定。,2、总变量分析法(终点法或平衡法),酶法（续）,分析方法的几个重要问题,、被测底物的浓度应很小，并控制反应于一级反应水平。防止过多的产物生成，避免逆反应。,、其它因素应尽量处于最适水平，双底物反应的另一底物应具有足够高的浓度。,反应本身要求酶的用量要高，以保证较快地达到终点，但由于酶的价格昂贵，因此适宜用量即为一个重要问题。,、酶的用量要适宜。一般而言，工具酶用量可控制在l-2Km单位(U/m1)左右。而终点法的测定时间多控制在2-l0min。,酶法（续）,（三）、酶法应用示例,示例一、胰蛋白酶效价测定,基本原理,胰蛋白酶能专一地水解肽键、酰胺键及酯键。目前底物采用专属性较高的N-苯甲

42、酰L精氨酸乙酯，在胰蛋白酶作用下水解为N-苯甲酰L精氨酸。通过底物在253nm处体系吸光度的变化速率来表达酶促反应的速率，从而用该连续测定法测定胰蛋白酶的效价。,测定方法：请参见教材p341,酶法（续）,示例二、胃蛋白酶的活力测定,基本原理,胃蛋白酶催化血红蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸，同时基于三氯醋酸使血红蛋白变性而沉淀的性质，使蛋白水解反应终止。从而利用取样测定法（或终止反应法）测定胃蛋白酶的活性，其水解产物氨基酸浓度的变化速度将根据水解产物中酪氨酸在275nm处的紫外吸收进行测定。,测定方法：请参见教材p342,三、电 泳 法,在电解质溶液中，不同的带电粒子在电场作用下，以不同

43、的迁移速度向其所带电荷相反的方向进行电极迁移。基于不同粒子的特定迁移速度，使组分分离成狭窄的组分带，从而分析检测相应的物质。,（一）电泳法的基本原理和分类,迁移速度服从于下述方程：v = ueE其中，v为离子移动速度，E为电场强度，ue为电泳迁移率。,基本原理,电泳法（续）,迁移速度服从于下述方程：v = ueE其中，v为离子移动速度，E为电场强度，ue为电泳迁移率。,电泳迁移率ue，在介质一定时，其值仅与带电粒子的性质有关，为其特性常数，据此对物质进行分析鉴定。,分 类,电泳法（续）,在电场作用下，溶液中的同种分子具有相同的泳动速度，不同种类的分子其泳动速度不同。电场将逐渐密集同种分子，而与

44、其他电泳速度不同的物质之间形成明显的界面，从而进行分离鉴定。,基本原理,特 点,a)、在溶液中电泳，无惰性支持介质。,b)、不同种类物质之间形成界面，这种界面可以是完全分离的，也可以是部分分离的。,1、自由界面电泳(Moving-boundary Electrophoresis),电泳法（续）,惰性介质支持的溶液组分，在电场作用下，基于不同组分与惰性介质的物理相互作用的差异以及不同组分的电学性质差异，使不同组分在该介质上具有不同的泳动速度，形成各自组分的区带，从而分离、分析溶液组分。,基本原理,2、区带电泳(Zone Electrophoresis),特 点,a)、存在惰性支持介质。,b)、电

45、泳最终会使不同组分形成明显的分离区带，具有较好的分离性。,电泳法（续）,HPCE是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或（和）分配系数不同进行高效、快速分离的一种电泳新技术。,基本原理,3、高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis, i.e. HPCE),特 点,a)、高效、快速、样品用量少 。,b)、容易自动化、操作简便、溶剂消耗少、环境污染小,电泳法（续）,用滤纸作为支持介质的一种电泳方法。, 测定方法,a) 选择缓冲液：基于供试品的性质、电泳速度和分辨率，考察缓冲液的组成、pH值和离子强度。,b）剪裁滤纸：宽度由样点数确定，样点间距为2-3cm；长度由电源输出最高电压及所需的电场强度而定，电压恒定时，所需场强越大，滤纸裁得越短。,