1、细胞免疫学技术种类细胞免疫学技术主要是对各种免疫细胞进行细胞免疫学技术主要是对各种免疫细胞进行分离、鉴定、计数，并测定其功能分离、鉴定、计数，并测定其功能 。 细胞分离技术细胞分离技术免疫细胞表面标志和功能的检测免疫细胞表面标志和功能的检测T细胞表面标志和功能的检测细胞表面标志和功能的检测B细胞表面标志和功能的检测细胞表面标志和功能的检测NK细胞活性的检测细胞活性的检测吞噬细胞检测技术吞噬细胞检测技术Date 1第一节第一节 免疫细胞的分离技术免疫细胞的分离技术n 一、标本的采取与保存n 二、细胞分离技术n 三、分离标本的保存技术Date 2第一节第一节 细胞的分离技术细胞的分离技术n 一、标
2、本的采取与保存n （一）血液标本的采取 无菌采血，抗凝n 1、机械去纤维蛋白法（玻璃珠法） 采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但本法简便、对淋巴细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。n 2、肝素抗凝法 肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，防止血液凝固。 n 3、乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝法 EDTA为螯合剂，可与血液中钙离子结合而抗凝。 n 马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠
3、由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。马、牛、 羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、 前腔静脉或耳静脉采血， 家禽由翼下静脉或心脏采血， 兔由心脏或耳静脉采血， 犬由颈静脉或四肢静脉采血， 豚鼠由心脏采血， 小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。Date 3第一节第一节 细胞的分离技术细胞的分离技术n 一、标本的采取与保存n （二） 胸腺细胞悬液的制备 n 【 方法 】 4周龄健康小鼠，体重 1416g。n （ 1）小鼠颈椎脱臼处死。n （ 2）迅速取出胸腺。置于 100目钢网上。注意无菌，洗干净胸腺上的血管。n （ 3）轻轻研磨，制成细胞悬液。n （ 4）用台盼蓝
4、染色，计数。活细胞数 90%。看视频Date 4第一节第一节 细胞的分离技术细胞的分离技术n 一、标本的采取与保存n （三）巨噬细胞的采取n 1、人巨噬细胞的收集（斑蝥酊敷贴法）n 2、小鼠腹腔巨噬细胞的制备n 【 方法 】 20-25g小白鼠n （ 1）小鼠颈椎脱臼处死n （ 2）腹部消毒，无菌注入肝素 -Hanks液n （ 3）吸出腹腔液，洗涤，计数，调整细胞浓度Date 5第一节第一节 细胞的分离技术细胞的分离技术二、细胞分离技术（一）外周血白细胞的分离 n 根据人外周血红细胞与白细胞的比重不同，其沉降速度随之而异。n 1、自然沉降法 利用 RBC自然沉降率较快的分离法。n 抗凝血于室温
5、或 37 静置 3060分钟，血液即分成明显的 3层：n 上层为淡黄色血浆，n 紧贴红细胞上面的灰白层为白细胞n 底层为红细胞n 本法所得的白细胞损伤极轻微。 Date 6第一节第一节 细胞的分离技术细胞的分离技术n 一、标本的采取与保存n （一）外周血白细胞的分离 n 2、加速红细胞沉降法 n 利用高分子量的聚合物（明胶）使红细胞凝聚成串钱状，借以加速红细胞沉降，使之快速与白细胞分离。n 上层富含白细胞n 红细胞凝聚成串钱状沉积在底层，n 本法的细胞得率比自然沉降法高，但明胶增加白细胞粘性，对实验有所影响。Date 7第一节第一节 细胞的分离技术细胞的分离技术n 一、标本的采取与保存n （二
6、）外周血单个核细胞的分离 （ PBMC）n 基本原理 根据人类各种血细胞的比重有所不同，利用一种比重介于1.0751.092之间而接近等渗的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而得以分离各种血细胞群。表 7 人外周血细胞密度一览表细胞 密度（ kg/m3）红细胞 1.092粒细胞 1.0701.090淋巴细胞和单核细胞 1.0601.075血小板 1.0301.035Date 8第一节第一节 细胞的分离技术细胞的分离技术n 一、标本的采取与保存n （ 三）淋巴细胞及其亚群的分离 n 1、淋巴细胞的分离n 玻器吸附法 将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内，置 37
7、 30 min 40min，用毛细吸管轻轻吸取悬液，即为淋巴细胞。用适量的 Hanks液冲洗平皿，收获即为单核细胞悬液。 n L-亮氨酸甲基酯法 n 单核 -巨噬细胞内富含溶酶体酶，它能摄取嗜溶酶体的 L-亮氨酸甲基酯，集中于溶酶体上，使该酯转化为对细胞本身有毒性的 L-lencyl亮氨酸甲基酯，但不影响 T、 B、 NK等细胞。用本法获得的淋巴细胞纯度大于 99，活力 95。Date 9第一节第一节 细胞的分离技术细胞的分离技术n 一、标本的采取与保存n （ 三）淋巴细胞及其亚群的分离 n 2、淋巴细胞亚群的分离 n 根据表面的标志不同，建立能选择性纯化所需细胞的技术。n E花环试验 分离 T细胞群n 尼龙毛分离方法 分离 T、 B细胞n 亲和层析原理分离淋巴细胞亚群 去除某一细胞群n 荧光激活细胞分离仪（ FACS） 最佳分离方法n 磁性微球用于细胞的分离和纯化（ MACS技术 ）Date 10
