第一向等电聚焦系统.doc

1、第一向等电聚焦（IEF）图示：Ettan IPGphor3等电聚焦仪器和Ettan IPGphor3控制软件双向电泳的第一向IEF电泳采用IPGphor，实验将变得很简单。IPGphor包括半导体温控系统 (18C-25C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。可采用普通型胶条槽一步完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。IPGphor 一次可进行 12个胶条槽的电泳(7, 11, 13 ，18 ，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。最新推出的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的IPG胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。 1IPG胶条的水化和

2、电泳（1）仪器：IPGphor （2）试剂： 水化液（8M尿素，2%CHAPS，15mM DTT和0.5%IPG缓冲液）：水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20保存，但不可反复冻融，尿素溶液加热温度不能超过37C，否则蛋白会发生氨甲酰化)。（3）实验步骤： 1）用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4%CHAPS ，2%IPG 缓冲液，40mM DTT，40mM Tris-base)溶解样品 。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml(若浓度过高，可以加 Lysis buffer稀释)，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。 2）吸取适量(见表2.1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条

3、中，不要加入过量的水化液。 表2.1IPG胶条所需水化液体积 3）从酸性端（尖端）一侧剥去 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG 胶条尖端(阳性端 )朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中（酸性端抵住胶条槽底端） ，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极) ，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。4）IPG 胶条上覆盖适量（1.5mL）Immobiline DryStrip 覆盖油（从两侧往中间加） ，盖上盖子。5）将标准型胶条槽的尖端背面电极与 IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 IPGphor 仪器的阴极平

4、台接触 （在此过程中，需用水平仪检查平台是否平衡，然后用两块白色条形板压在胶条槽上，最后盖上 IPGphor 的盖子） 。6）设置 IPGphor 仪器运行参数： IPG 胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见表 2.2 。表 2.2： IPGphor 运行条件步骤 电压 时间S1 Stp 30V 11:00HrS2 Stp 100V 1:00HrS3 Grd 1000V 1:00HrS4 Grd 8000V 2:00HrS5 Stp 8000V 50000VhrS6 Stp 500V 12:00Hr低电压时水化，有利于高分子量蛋白进入胶中，并减少蛋白形成聚集体

5、。7）IPG 胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。8）暂时不进行第二向的 IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于 -80C 保存几个月。注意：不推荐每条 IPG 胶条的电流超过 50A，因为这有可能产生过多的热量且有可能损坏胶条和槽，IPG 胶条甚至会烧胶。附注：一向等电聚焦电泳需 21-22h2IPG胶条的平衡IPG胶条平衡两次，每次15min。平衡缓冲液包括6M尿素和30%甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。第一步平衡在平衡液中加入DTT，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的DT

6、T烷基化( 银染过程中，DTT会导致点拖尾“point streaking“) 。将IPG 胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向SDS 胶中。 注：如果缩短平衡时间，会影响一部分蛋白从IPG胶条转移到SDS胶的效率。这种情况下建议在蛋白从 IPG胶条转移到SDS胶后，将IPG胶条染色，以检查是否所有蛋白都已离开IPG胶条。（1）仪器：平衡管 (200 mm 长, 20 mm i.d.), Parafilm, 水平式摇床第一向等电聚焦电泳参数设置参数设置30V，11Hr100V，1Hr1000V，1Hr8000V，2Hr8000V，60000VHr500V，Hold（2）实验步骤

7、： 1）使用前每10ml平衡缓冲液中加入 0.1g DTT(相当于平衡缓冲液I)，取出IPG胶条分别放入平衡管中(支持膜贴着管壁，每个平衡管中放入一条IPG胶条)，用Parafilm封口，报纸盖上平衡管，避光，在水平式摇床上摇晃15分钟，倒掉平衡缓冲液I。 2）每10ml平衡缓冲液加入 0.3g碘乙酰胺 (相当于平衡缓冲液 II)。将IPG胶条转移至平衡缓冲液 II中，用Parafilm封口，报纸盖上平衡管，避光，在水平式摇床上摇晃15分钟。（注：平衡缓冲液和用同一平衡管，即先用DDT平衡，缓缓地倒掉 DDT，小心别把IPG胶条倒掉，再加入IAA进行平衡即可。每根胶条一般需10ml平衡液，如若

8、要平衡3根胶条，洗2个50ml离心管，分别称量0.1g3=0.3gDDT和0.33=0.9gIAA，各加入30ml）。附注：在胶条平衡未完之前，进行剥胶，用ddH 2O冲洗胶板，去除板上碎胶，并加满ddH 2O置于支架上，一段时间后，将ddH 2O倒掉，用滤纸片吸干水分，并吸取加热后的琼脂糖密封液灌满胶板空隙。3）IPG胶条的转移：用镊子取出IPG胶条，将胶条的支持面（即带字的面，不能是胶面）边缘置于滤纸上几秒钟，以去除多余的平衡缓冲液，并将胶条浸泡在2SDS电泳缓冲液中数秒钟。然后，将IPG胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持面贴着其中的高板，用一薄尺将IPG胶条轻轻地向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。确保在IPG胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。4）最后往胶板空隙中补满琼脂糖密封液（温度不高于65），使IPG胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡，放置一会儿，直至凝固。附注：配置新鲜上槽液1.2L=480mL+ddH 2O至终体积（将5Laemmli SDS电泳缓冲液稀释至2，加水至），用1mL的量筒配置并存放（因为在转移IPG胶条之前，先得在缓冲液中浸泡数秒钟）倒入Ettan DALTsix上槽中，下槽液为1电泳缓冲液，可重复利用。缩略词表：IPG：immobilizedmob,laz PH gradient