质粒转化大肠杆菌.doc

1、实验 26质粒转化大肠杆菌该实验主要有两个用途：1重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化） ，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要 2030 分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养

2、，可以在短时内极大地扩增目的质粒。 （作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。 ）原 理本实验通过 CaCl2 对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒 DNA，如一些插入目的 DNA 片段的重组质粒，产生 51062107 个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在 42的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入 LB培养液，于 37振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。实验准备一器材天平

3、、秤量匙、秤量皿加热磁力搅拌器、搅拌子可调移液器 P1000、P200 、P20 及其经消毒的盒装蓝、黄吸头经消毒的 1.5ml Eppendorf 管、试管架及其水浴用试管架定时器、记号笔、一次性手套和筒纸42恒温水浴4和-70冰箱煤气灯或酒精灯恒温培养摇床（调至 37，225rpm）37培养箱玻璃涂棒（普通玻璃吸管，细头部在煤气灯上烧成“L”形）消毒过的洁净培养皿（直径 10cm）二试剂LB 培养基细菌培养用胰化蛋白胨 10g细菌培养用酵母提取物 5gNaCl 5g 加 800ml 水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用 5M NaOH（约 0.2 ml）调节 pH 值至 7

4、.0，加水定容至 1000 ml。高压 15 lbf/in2（1.03410 5pa）消毒 30 分钟，冷却后可加入氨苄青霉素（ 50mg/ml）500ul，视载体特性而定，混匀，即为含抗生素的 LB 培养液。存放于避光处。含有琼脂的培养基即在以上 1000ml 培养基中加入 15g 细菌培养用琼脂。抗生素琼脂平板待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿，约 3050 ml，用煤气灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，于 4冰箱内避光保存。pH 试纸（或 pH 计）三实验材料来源于实验一的重组质粒受感态大肠杆菌碎冰及碎冰保温盛器 实验步骤自-70冰箱中取出

5、受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约 15 分钟，轻轻混匀。吸取50ul 移入 1.5ml 管，并立刻将细菌放回-70冰箱。细菌 50 ulDNA 5 ul 轻轻混匀，静置冰上 30 分钟。于 42水浴中热休克细菌 45 秒，迅速移入湿冰中，静置 2 分钟，加入 900ul LB 培养液，放入 37恒温箱摇床，225rpm 摇晃培养 1 小时。取 50ul 涂于含氨卞青霉素的 LB 琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于 37的培养箱中过夜。次日，检查各培养皿中是否出现菌落。实验结果转化成功，培养皿中可见散在的菌落。转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。实验

6、 27 阳性单菌落扩增与小量 DNA 制备目 的1为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒 DNA。排除自身环化。鉴定方法主要有：（1）PCR 法及其利弊。采用载体两端的引物进行 PCR，一旦插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的 PCR 产物。（2）Southern blot 法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作 Southern blot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。（3）酶切鉴定法及其利弊。2提供一定数量的 DNA 以满足一些实验，比如 1）测序、2）准备杂交用的探针

7、。这便是本实验的两个主要目的。有关微型真空柱和离心柱的利弊。原理与本实验近似，区别在于 DNA 的回收不是采用酒精沉淀，而痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续的工作困难。原 理挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体 DNA、高分子量的 RNA 得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒 DNA 溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后，得到质粒 DNA。实验准备一器材Falcon 2070 管台式 Eppendorf 管离心机可调移液器 P1000、P200 、P20 及其经消毒的盒装蓝、黄吸头经

8、消毒的 1.5ml Eppendorf 管、试管架及其水浴用试管架定时器、记号笔、一次性手套和筒纸4和20冰箱煤气灯或酒精灯恒温培养摇床（调至 37，240rpm）台式 4 Eppendorf 管离心机离心真空干燥器37水浴二试剂含抗生素的 LB 培养液TE（10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0）100预冷乙醇75预冷乙醇RNase （10mg/ml）3M NaAC溶液 I50 mM 葡萄糖25 mM Tris.Cl （pH 8.0）10 mM EDTA （pH 8.0） 在 10 lbf/in2（6.895*104pa ）高压灭菌 15 分钟，贮存于 4。溶液 II0.2 N

9、NaOH1 SDS溶液 III5 M 乙酸钾 300 ml冰乙酸 58 ml水 142 ml 存于 4。消毒过的双蒸水三实验材料含阳性菌落的培养皿碎冰及碎冰保温盛器实验步骤1第一天（通常为下午）从琼脂平板上挑取单一菌落，接种到 Falcon 管内的 5ml LB 培养液（含氨卞青霉素）中。放入 37恒温摇床，225-250 rpm 剧烈摇晃培养过夜（O/N） 。2第二天（通常上午开始）（1）吸取 1.5ml 培养液，移入 Eppendorf 管中，台式离心机室温下 1.4 万转离心 2 分钟，弃上清，重复一次，以取得较大的沉淀。剩余培养液存入 4冰箱。（2）弃上清，加入 100ul 溶液 I，

10、盖上盖，剧烈震荡（可以将管底抵于试管架面上，划 15 下） ，充分浮悬细胞沉淀，置-20 冰箱内 5 分钟。（3）自冰箱中取出试管，加入 200ul 溶液 II，轻轻颠倒混匀，放于冰上 5 分钟。（4）加入 150ul 溶液 III，轻轻颠倒混匀，放于冰上 15 分钟。（5）放入台式离心机，室温下 1.4 万转离心 3 分钟，将上清移入一新的 Eppendorf 管，加入 1ml 100乙醇，混匀，放入-20 冰箱 5 分钟。（6）自冰箱中取出试管，迅速移入 4环境下的台式离心机，1.4 万转离心 5 分钟，小心弃去上清，倒置试管于纸巾上流尽乙醇。（7）加入 300ul TE 和 2ul RNase，重浮悬沉淀，放试管于 37的水浴中温育 30 分钟。（8）加入 3M NaAC 34ul，混匀，加入 1ml 预冷的 100乙醇， -20存放 5 分钟。（9）自冰箱中取出试管，迅速移入 4环境下的台式离心机，1.4 万转离心 5 分钟，弃去上清。（10）加入 1ml 预冷的 75乙醇，迅速移入 4环境下的台式离心机， 1.4 万转离心10 分钟，弃去上清。（11）旋转真空干燥 10 分钟。于冰上，溶解沉淀于 20ul 水中。实验结果通常可获得 35ugDNA。