1、质粒 DNA 电泳的三条带2008-11-11 16:38质粒是细胞内的一种环状的小分子 DNA,是进行 DNA 重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外,质粒 DNA 上携带了部分的基因信息,经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在 DNA重组中,质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主细胞中提取质粒 DNA,是 DNA 重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA 有三个步骤:1、培养细菌使质粒扩增2、收集和裂解细菌3、分离和纯化质粒 DNA碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高,适合于大多数的和菌株,所得产物经纯化后可满足多
2、数的 DNA 重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6 的碱溶液使 DNA 发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同,变性时前者虽然两条链分离,但仍然缠绕在一起不分开;而后者完全变性分,甚至出现断裂。因此,当加入中和液时,溶液 Ph 值恢复较低的近中性水平,此时, 质粒的两条小分子单链可迅速复性,恢复双链结构,但是主染色体 DNA 则无法复性。在离心时,大部分主染色体与细胞碎片,杂质等缠绕一起被沉淀,而可溶性的质粒 DNA 留在上清夜中。在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的原因,可能使质粒 DNA链发生断裂。所以,多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒:共价闭合环状 DNA(ccc
3、DNA): 质粒的两条链没有断裂;超螺旋开环 DNA(ocDNA): 质粒的一条链断裂;松弛的环状分子线形 DNA(lDNA): 质粒的两条链均断裂;线性分子质粒 DNA 的分子构型 质粒 DNA 琼脂塘凝胶电泳模式图(a)松弛线性的 DNA;(b)松弛开环的 OC 构型;(c)超螺旋的 SC 构型由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭,因此,在紫外线照射下 DNA 电泳带成橘黄色。(a)道中的 SC DNA 走在最前沿,OC DNA则位于凝胶的最后边;(b)道中的 L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的,它在凝胶中的位置介于 OC DNA 和 SC DNA 之间三、材料、试剂及器具1、
4、材料E.coliDH 5(pUC 19 vector)2、试剂1)LB 培养基2)TE 缓冲液3)裂解液:溶液、溶液、溶液4)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)5)无水乙醇6)70%乙醇7)氨苄青霉素 50mg/mL器具离心机、离心管、吸嘴四、操作步骤以 1%比例把 E.coliDH5(含 PUC18)接种于含氨苄青霉素(Amp)100g/ml)的LB 培养基中 37振摇过夜(12-18h)取 1.5ml 培养物置离心管中10000rpm,离心 1min,或 4000rpm,离心 5-10min去上清,倒扣干净吸收纸上吸干沉淀+100L 溶液加或不加入少量溶菌酶粉末;混匀,室温放置 10min
5、+加 200L 溶液(新鲜配置)温和颠倒数次,混匀,冰上放置 5min+150l 溶液颠倒混匀,冰上放置 15min离心 12000rpm,15min上清液+等体积酚:氯仿:异戊醇振匀,12000rpm,离心 5min小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质上清液+2 倍体积无水乙醇混匀,室温 5min-10min12000rpm,5min-15min弃上清沉淀+1mL70%乙醇12000rpm 离心 5min-15min弃上清;并倒扣离心管使液体流干+自然干燥或真空抽干(看不到液滴为宜)加 50lTE 缓冲液(20g/mlRNaseA)溶解质粒粗取物-20保存六、实验报告检查、保存提取的质粒,要求记录实验现象并说明原因。七、思考题分析以下试剂的作用原理:溶液:50mmol/L 葡萄糖5mmol/Ltris HCL (Ph 8.0)10mmol/L EDTA(PH8.0)溶液:0.4mol/L NaOH2% SDS使用前新鲜配制溶液:5mol/L Kac 60 mL冰醋酸 11.5 mL水 28.5 mLRNase A 酶:将粉末溶于 10mmol/L tris HCL (Ph7.5)、15mmol/L NACL 中,配成 10 mg/mL浓度的酶液,于 100水浴加热 15 min,缓慢冷却至室温,-20保存氯仿无水乙醇