生物样品预处理技术.ppt

1、生物体内药物分析选论生物体内药物分析选论 生物体内样品及其预处理技术生物体内样品及其预处理技术 生物体内药物分析的特点 常规药物分析： 原料药物和药物制剂分析 真伪鉴别、纯度检查、含量测定 共存杂质、制剂辅料、复方药物 生物体内药物分析：复杂生物样品的微量分析 药物浓度低 样品采量少 干扰成分多 研究对象 血样 尿液 唾液 胆汁 组织器官 预处理方法 分离 纯化 浓集 实验结果 测定 动物实验 方法学考察和验证 样品前处理 样品分析 数据处理 具体考虑生物体内药物分析的研究对象即生 物体内样品，则需要从生物样品来源、样品种 类和检测组分三方面来讨论。 1. 生物样品来源：决定于研究的目的 人体

2、与动物 2. 生物样品种类：如体液、器官、组织和排泄物等 3. 检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等 生物样品来源 临床前 吸收试验 组织分布试验 代谢 排泄 毒代动力学 临床 临床药代动力学 制剂生物利用度及生物等效性 生物样品种类 生物样品种类选取的一般原则： （ 1）必须是能够反映出浓度与药物效应 之间关系； （ 2）易于获得； （ 3）便于处理，适合于分析； （ 4）根据不同目的与要求进行选取。 生物样品种类可分为 均匀生物样品： 血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、 乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液和性腺分泌液等体液 呼出气体 非均匀生物样品： 心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、

3、子宫或睾丸、 脂肪、肌肉、皮肤等器官、组织 粪便排泄物 生物样品种类 检测组分 即生物样品中的药物及其代谢物等 （ 1）原形药物的测定； （ 2）游离药物的监测； （ 3）活性代谢产物的监测； （ 4）药物对映体的监测； （ 5）作用部位药物浓度的测定； （ 6）体内内源性物质的测定。 一、生物样品的一般处理原则 生物样品贮存 生物样品均匀化 结合物水解 生物基质的性质 测定对象的性质 一、生物样品的一般处理原则 生物样品的贮存 采集哪种生物样品：血浆、血清、全血、尿、组织 血浆酯酶引起的水解 血浆样品 加入酯酶抑制剂 微生物导致的腐败 尿液样品 加入防腐剂冷藏 储存条件 20 ：大部分药物

4、80 ：阿莫西林等抗生素 加稳定剂：卡托普利等 立即测试：维生素 C等 一、生物样品的一般处理原则 生物样品均匀化 体液样品： 尿液、血浆 涡旋混匀 固体样品： 组织、粪便 加入适量溶剂进行高速匀浆 一、生物样品的一般处理原则 结合物水解 相代谢产物如葡萄糖醛酸结合物、硫酸酯类结合物 极性大、亲水性、不易于提取富集 酸水解： 简便、快速，不具备专一性，注意药物是否 被破坏 酶水解： -葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，专一性强，时 间长，实验费用高 二、生物样品预处理方法 预处理的目的： 去蛋白，释放药物 样品纯化和富集 满足分析方法灵敏度的需要 防止分析仪器的污染和劣化 满足大量样品分析的需要 微量、快

5、速 二、生物样品预处理方法 常用的生物样品预处理方法 沉淀蛋白 液液萃取 液固提取 二、生物样品预处理方法 沉淀蛋白 操作： 50l血 浆 150 l甲醇 涡旋 1min 3500rpm离心 10min 取上清液进样分析 常用沉淀剂： 与水能混溶的有机溶剂 甲醇、乙腈 酸性沉淀剂 三氯醋酸、高氯酸 二、生物样品预处理方法 应用中注意问题： 去蛋白后的上清直接进样对色谱分离及色谱柱和仪 器的影响 v 色谱峰形 v 液质联用分析中的基质效应 检测灵敏度是否足够 二、生物样品预处理方法 液液萃取 操作： 血浆一定体积萃取溶剂 振荡 /涡旋萃取 3 5min3500rpm 离心 10min 取上清液氮

6、气下吹干 流动相 复溶后进样分析 溶剂的选择与纯度的要求 有机溶剂相和水相的体积 水相的 pH 值 二、生物样品预处理方法 常用的液液萃取溶剂： v 正己烷 v 叔丁基甲醚 v 乙醚 v 乙酸乙酯 v 正丁醇 * 相似相容原理进行选用 沸点低、易于挥散和浓集 不易乳化、不影响紫外检测 体积选择依实验考察 极性增加 二、生物样品预处理方法 水相的 pH值 水相 pH值主要由药物的 pKa确定 对于碱性药物最佳 pH值要高于 pKa值 1 2个 pH单位 对于酸性药物要低 1 2个 pH单位 碱性药物在碱性 pH值、酸性药物在酸性 pH值介质 中提取 血浆加入 1M NaOH进行碱化后用适合溶剂提

7、取 二、生物样品预处理方法 液液萃取的优点： 选择性高 便于纯化和富集 操作方便 对仪器的污染小 缺点： 易产生乳化 操作费时，不易于自动化 二、生物样品预处理方法 液固提取 固相萃取 超声提取 对于固体生物样品，如粪便，组织等 ，匀浆处理后，用合适的有机溶剂进行液固萃取， 涡旋振荡提取或者超声提取，上清液吹干或者进行 第二次液液萃取，以便进一步的纯化富集 二、生物样品预处理方法 固相萃取 操作： 活化 上样 淋洗 洗脱 收集 直接进样或者 浓缩后进样 与色谱理论相同 二、生物样品预处理方法 二、生物样品预处理方法 采用离心或者抽真空 的办法，以一定离心 力或者流速，进行上 样、淋洗和洗脱 二

8、、生物样品预处理方法 固相萃取的优点： 无乳化现象 使用溶剂安全价格低廉 萃取效率高 处理速度快，具有一定通量 易于同时萃取出目标药物及其代谢产物，包括极性 强的 相代谢产物 MCX固相萃取柱 反相作用和阳离子交换 作用 酸性环境中含氮碱性基 团与磺酸基结合 酸性药物呈分子状态发 生反相结合作用 示例 不同生物样品中虎杖苷预处理方法 A：虎杖苷标准对照品 由海王集团技术中心天然药物室提供 批号： 03050803 3， 4， 5-三羟基芪 -3-D-葡萄糖苷 Mr390 B：二苯乙烯苷化学对照品 由中国药品生物制品检定所提供 2， 3， 5， 4-四羟基二苯乙烯 -D-葡萄糖苷 Mr406 示

9、例 不同生物样品中虎杖苷预处理方法 SD大鼠血浆样品： 乙腈 沉淀蛋白 ；操作简便快速，适用于大量样品；色谱柱污 染和不可逆堵塞 组织和排泄样品： 0.5mol/L磷酸二氢钠酸化样品后，乙酸乙酯 正丁醇 51进 行 液液萃取； PD较大的亲水性，常规溶剂萃取效率很低，故 选择混合溶剂来提取；富集使得灵敏度提高；吹干时间长 J Pharm Biomed Anal,41(2006):240-245 示例 不同生物样品中虎杖苷预处理方法 犬血浆样品 ： 固相萃取 0.5mol/L磷酸二氢钠酸化样品后，上柱， 20甲醇淋 洗后用 100甲醇洗脱，吹干后流动相溶解进样；同时可以获 得 II相代谢产物的富

10、集；易于自动化 色谱柱： DiamonsilTM C18（ 5m ， 2004.6mm） 分析柱前备有 Supelco保护柱 流动相：甲醇 -水（ 3565） 流 速： 1.0ml/min 紫外检测波长： 290nm(0.0005aufs) 柱 温： 251 J Pharm Biomed Anal,41(2006):240-245 示例 不同生物样品中虎杖苷预处理方法 蛋白沉淀 （ SD大鼠血浆） 固相萃取 （犬血浆） 示例 不同生物样品中虎杖苷预处理方法 液液萃取（肾组织） 液液萃取（尿液） 液质联用对样品预处理的要求 基质效应的存在 基质效应可认为是样品中分析物周围所有成分的集 体干扰行为

11、 除分析物外样品中所有其它成分所引起的分析误差 ，尤指来自生物样品中 未知的或性质不确定的成分 或体系特性 (如粘密度、离子强度、表面张力等 )所 引起的干扰 基质效应的程度在不同动物、不同个体来源的样品 之间和在同种基质处于不同时期样品之间都会呈现 一定的差别 液质联用对样品预处理的要求 不同样品预处理技术对基质效应的影响 采用柱后灌注法研究 待测化合物 预处理后血浆 样品进样 液质联用对样品预处理的要求 甲醇沉淀蛋白 Oasis 固相萃取 叔丁基甲醚 液液萃取 正常离子信号强度 离子信号增强 离子信号抑制 液质联用对样品预处理的要求 离子抑制严重 离子增强且不稳定 J Chromatogr

12、 B,850(2007):101108 液质联用对样品预处理的要求 选择合适的样品预处理条件 合适的蛋白沉淀剂 合适的固相萃取柱 合适的萃取溶剂 不同 QC浓度下，对目标化合物引起的基质效 应方向相同、数值相近 对内标化合物引起的基质效应与目标化合物 相差较小、方向一致 在以上条件满足的基础上，做到样品快速预处理 6% Analysis 6% Sample collection 61% Sample preparation 27% Data processing 分析过程中的时间消耗分布 三、生物样品预处理方法发展 沉淀蛋白后过滤 96孔蛋白沉淀板 p 蛋白沉淀 p 沉淀后离心取上清液 p 沉

13、淀后过滤得上清液 Sirocco p 操作不同 p 传统 p 50l血浆 +200l甲醇（含内标 20ng/ml） 振摇 5min 离心 15min 取 上清进样 p Sirocco p 200l甲醇（含内标 20ng/ml） + 50l血浆 振摇 5min 真空抽滤 直接进 样 样品前处理 应用研究应用研究 样品前处理 p 减少移液步骤 p 减少交叉污染 p 减少离心等环节，节省时间 应用研究应用研究 三、生物样品预处理方法发展 与传统的蛋白沉淀相比具有以下优点： 引起较小的紫外检测和质谱检测的干扰 节约预处理时间，具有较大样品通量 便于实现自动化，便于与 96孔自动进样器匹配 引起柱压的较

14、小波动，保护色谱柱 过滤 离心 96孔板样品前处理 50 l血浆 +甲醇 150 l（含内标 1 g/ml） 振摇 5 min 2500 g下离心 15 min 离心结束后准确移取上层清液 100 l至另一 96孔板（ 350 l ），用 100 l流动相稀释混匀后置进样器上进样 LC-MS/MS 分析 流动相 空白血浆 标准曲线 QC样品 样品 样品 样品 空 样品前处理 p 采用 Sirocco蛋白沉淀板进行前处理和传统蛋白沉淀的比较 p 离子抑制程度减轻，去除了大多数极性小的内源性物质 p 绝对回收率提高 应用研究应用研究 46 示例 n 仲胺 N，显示弱碱性，游离碱难溶于水，易溶于 有

15、机溶剂，盐可溶于水 盐酸克仑特罗 (Clenbuterol Hydrochloride) 苯乙胺类拟肾上腺素药， -受体激 动剂 ，用于平喘 47 示例： 血浆 中 盐酸克仑特罗 的测定 n 取血浆 0.2ml，加入 0.1 mol/l NaOH 50l，涡旋混匀后 加入 乙酸乙酯 2ml液液萃取，涡旋提取 3min，离心，取 乙酸乙酯层置于另一干净离心管中，氮气流下 50 水 浴挥干，残余物用 50l 流动相 溶解后，取 10l 进样 LC -MS分析测定。 由于长期用药的不良反应等， SFDA已经于 2011年停止生产 、销售和使用盐酸克仑特罗片，其他剂型及复方仍可以使用 。 48 示例：

16、 猪肉 中 盐酸克仑特罗 的测定 n 盐酸克仑特罗，俗称 瘦肉精 ，具有营养再分 配作用，被不法养殖户用作药物促生长添加 剂，提高动物的瘦肉率 n膳食暴露与 食源性疾病 49 示例：猪肉中 盐酸克仑特罗 的测定 n 取 500g有代表性的猪肉可食部分，用组织捣碎机充分 捣碎均匀 ； n 取 2g 捣碎样品，加入 8ml乙酸钠缓冲液 (pH=5.2)，再 加入 50l-葡萄糖醛酸苷酶 /芳基硫酸酯酶溶液 ，涡旋 混合， 37 下避光 水浴震荡 12h。 样品均匀化 缀合物水解 50 示例：猪肉中 盐酸克仑特罗 的测定 n 然后加入 0.1mol/l 高氯酸溶液 5ml，混匀， 用高氯酸 调 pH

17、至 10.3，离心取 上清液 ， 用氢氧化钠调 pH至 11 ，加入 10ml乙酸乙酯 -异丙醇混合液和 10ml饱和氯化 钠溶液 ，震荡 10min离心， 收集有机相， 40 下水浴 氮吹 ， 5ml乙酸钠缓冲液 (pH=5.2)溶解，待净化。 调节 pH，进行液液萃取 51 示例：猪肉中 盐酸克仑特罗 的测定 n 取待净化液过 MCX柱 (3ml甲醇、 3ml水 活化 ，待净化 液 上样 ，再依次用 3ml水， 3ml 2%甲醇 -水溶液， 3ml 甲醇淋洗， 5ml 5%氨水 甲醇溶液洗脱 )，洗脱液在 40 水浴中用氮气吹，浓缩至 1ml，再用 0.45m滤膜 过滤，即获得样品溶液。

18、n MCX柱 混和弱阳离子交换柱 n 疏水相互作用 +阳离子交换 -两种作用使药物保留 固相萃取 52 n 2g 猪肉 1ml 进样分析 FDA/WHO 0.2g/kg 日本 0.05g/kg 中国 0.1g/kg FDA/WHO 0.4 ng/ml 日本 0.1 ng/ml 中国 0.2 ng/ml 方法检测限量 分析对照品的最低定量限 生物样品取样量多少 生物样品前处理方法选择 三、生物样品预处理方法发展 液相微萃取 微滴式 现在常用离子液体为萃取剂，具有粘度大 ,能悬挂成更大的 液滴 ;且其挥发性小 ,液滴不易损失 三、生物样品预处理方法发展 液相微萃取 中空纤维式 将多孔性的中空纤维固

19、定在进样器的针头上 ,用于保护和容纳 有机溶剂 ,同时由于纤维上的多孔性 ,增加了溶剂与样品接触的 表面积 ,从而提高了萃取率 三、生物样品预处理方法发展 固相微萃取 操作原理与 SPE 近似，操作方法迥然不同 SPME 以熔融石英光导纤维或其它材料为基体支持物，采取 “相似相溶 ”的特点，在其表面涂渍不同性质的 高分子固定相 薄层 ，通过直接或顶空方式，对待测物进行 提取、富集、进 样和解析。 SPME 的基本原理和萃取机制可以描述为待测物在介质相和 / 或顶空相、及萃取纤维相的分配平衡过程，在一定条件下达 动态平衡时，涂层吸附的待测物的量与样品中的浓度成正比 ，以此作为定量分析的依据 三、

20、生物样品预处理方法发展 三、生物样品预处理方法发展 三、生物样品预处理方法发展 超滤法 使用一定孔径的滤膜，在高速离心力作用下使分子量 小的游离药物随血浆中的水分一道通过滤膜，但滤膜 能阻挡住血浆蛋白和与血浆蛋白相结合的药物 v测定体内游离药物浓度 v测定药时曲线上各点的 血浆蛋白结合率 示例： UF-LC/MS/MS方法的建立 由于超滤有效的除去了血浆蛋白，血浆水样品允许 采用直接进样方法，大大简化了样品的处理过程 用于 直 接 进样分析的超滤液由血浆在一定的离心 超滤条件下获得，为了与 LC/MS分析工作的匹配， 滤过液应具备一定量的体积以降低分析对检测灵敏 度的严格要求， UF通常更多地

21、在低离心速率 (300- 3000 g和较长的时间内 (15-60 min)完成，延长滤过 时间可以提高增加获得的体积，但牺牲了样品的分 析效率。 示例： UF-LC/MS/MS方法的建立 不同离心力下，不同离心时间后，超滤液的体积和蛋 白含量（样品 37 制备） 13362g，离心 3min，大于 99%的血浆蛋白被截留，滤 液体积满足 LC/MS/MS分析要求 示例： UF-LC/MS/MS方法的建立 以上条件下，滤液直接进样对色谱柱柱压的影响较小 示例： UF-LC/MS/MS方法的建立 可能产生的问题： 非特异性结合 药物结构和膜材料的特性决定 解决办法：缩短接触时间，预清洗减少过滤死

22、体 积 基质效应 血样的采集、存储等过程中引起的血液成分变化 抗凝剂的使用， EDTA，肝素钠等 不同物种的血浆影响 示例： UF-LC/MS/MS方法的建立 柱后灌注考察超滤法 引起的基质效应 50微升血浆 150微升甲醇 沉淀蛋白后，上清液等比 稀释进样 20微升 200微升血浆 13000g超滤 3min后，滤过液直接进样 20微升 测定血浆中福多司坦（依 达拉奉为内标） 三、生物样品预处理方法发展 联用技术 在线固相萃取 LC/MS/MS 固相微萃取 GC l 柱切换系统的搭建 12 3 4 5 6 三、生物样品预处理方法发展 四、样品提取回收率的计算 在体内药物分析中，对生物样品的制备方法 重点考虑的是方法的准确度（相对回收率） ，要求操作尽量简便、快速。 体内药物分析中一般提取一次，所以待测药 物不能被完全提取，其提取回收率 70则 认为有较好的绝对回收率； 80 90则是 可以接受的限度。 四、样品提取回收率的计算 提取回收率： QC样品经过制备处理后的检测信号 未经制备处理的相应浓度的标准溶液的检测信号 LC/MS 中提取回收率： QC样品经过制备处理后的检测信号 经过制备处理后的空白基质加上相应浓度标准溶液 考虑基质效应的影响 优化提取条件，提高提取回收率，提高检测灵敏度