抗体制药.ppt

1、 第一节 概述 1890年 Behring和北里柴三郎发现 白喉抗毒素 ,建立了血清疗法 ,开创了 抗体制药。 1937年 Tiselius用电泳法将血清蛋 白分离为白蛋白、 、 、 球蛋白，并 证明抗体活性主要存在于 球蛋白组分 。 抗体制药 抗体 是指能与相应抗 原特异性结合具有免疫功 能的球蛋白。 抗体的产生 ：机体免 疫系统受抗原刺激后， B 淋巴细胞被活化增殖和分 化为浆细胞，由浆细胞合 成和分泌的球蛋白。 抗体制药 抗体攻击病毒 凝 集 细 菌 免疫球蛋白的发现 20世纪 60年代发现多发性骨髓瘤是浆 细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血 清中出现 同抗体结构类似 的球蛋白，统称

2、为 免疫球蛋白 （ immunoglobulin， Ig）。 所以 Ig是化学结构的概念，而 抗体 是生物 学功能的概念。所有抗体是 Ig，但并非所 有 Ig分子都有抗体活性。 抗体制药 注射抗原 IgM IgG（ 10d， IgM） 抗体制药 初级免疫反应 5类在结构和功能上不同的 Ig 由长寿的 T细胞和 B细胞记忆 IgA： 唾液、肺、肠道等的分泌液。 IgE： 存在于已结合抗原的组织中。 IgD： 成熟的 B淋巴细胞表面。 至 2000年底，在美国药品市场上生物技术药物 有 76种，其中抗体药物有 15种。 2019年治疗用单抗销售总额已超过 52亿美元。 2019年约有 50-60个

3、治疗性单抗上市。 2019年预计单抗销售额 200亿美元。 美国已占全球单抗市场 90% 一支独秀 。 完全 人源化 单抗现有多个处于临床前阶段。 抗体制药 抗体药物 Antigenic determinant 抗原決定基（簇） 一个抗原分子上可能 有数个抗原決定基 每个抗原決定基至少诱生一种专 一性抗体 蛋白质性抗原決定基：含有 六个以上氨基酸 整体水平抗体生成技术 细胞工程抗体生成技术 基因工程抗体生成技术 多克隆抗体（抗血清） 单克隆抗体 嵌合抗体、改形抗体 “小型化抗体 ”（单链抗体） 组合抗体库技术 噬菌体抗体库技术 Ig基因转基因小鼠 抗体真核表达技术 抗体制药 多克隆抗体 （ p

4、olyclonal antibody） 指由不同 B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种 抗原决定簇的 多种抗体混合物 。如 :免疫血清（含多种 特异性抗体）。 实际意义 ： （ 1）预防、治疗感染性疾病 如：破伤风抗毒素血清 抗 破伤风； 胎盘球蛋白 抗病毒感染 等； 副作用： 超敏反应 （ 2）临床诊断 如：肥达氏反应 伤寒、副伤寒 缺点：特异性差， 易出现 非特异性交叉反应 。 抗体制药 超敏反应（ hypersensitivity ） 异常的、过高的免疫应答 。即机体与抗原性 物质在一定条件下相互作用，产生 致敏淋巴细胞 或特异性抗体，如与再次进入的抗原结合，可导 致机体生理功能紊乱和组织

5、损害的免疫病理反应 ，又称 变态反应 。引起超敏反应的抗原性物质可 以是完全抗原（异种动物血清、组织细胞、微生 物、寄生虫、植物花粉、兽类皮毛等），也可以 是半抗原（如青霉素、磺胺、非那西汀等药物， 或生漆等低分子物质）。 各种类型的超敏反应 型超敏反 应 ：主要疾病有：全身性 过 敏反 应 、皮 肤超敏反 应 、消化道超敏反 应 、呼吸道超敏反 应 。 型超敏反 应 ：主要引起的疾病有： 输 血反 应 、新 生儿溶血症、免疫性血 细 胞减少症。 超敏反 应 ：引起的疾病有 :血清病、感染后 肾 小 球 肾 炎、 类风 湿性关 节 炎、系 统 性 红 斑狼 疮 、 过 敏 性休克 样 反 应

6、、毛 细 支气管炎。 超敏反 应 ：主要 临 床疾病有 结 核菌素反 应 、 传 染性超敏反 应 、接触性皮炎、移植排斥反 应 传统 抗血清 抗 原 免 疫 所有抗 体 混合 1 23 4 1 2 3 4 1 23 4 脾脾 脏脏 淋巴結淋巴結 B 細胞細胞 抗 体 -a -b -c -d -a -b -c -d 抗原決定基 BALB/c a b b c d 传统抗体 (抗血清 ) 是所有抗 体 的混和 脾 脏产生各种 B 細胞 免 疫前要先 把抗原作 成乳 剂 免 疫 抗原 采 血 后 可得 传统 抗血清 已建立之小鼠 骨髓癌 细 胞株 由脾 脏 收集 B 細胞 抗原通常有多 个 抗原決定基

7、 免 疫 后 的脾 脏 约 在 两 月內 注射五到八次 Ag X 传统 抗血清的交叉反应 专一性反应 沒有反應交叉反应 + -? 1 2 3 Ag A x y z Ag B 1 2 0 Ag A 1 2 3 1 2 3 1 2 3 单克隆抗体的特点 q高度特异性 q均一性 q来源稳定 q可大量生产 抗体制药 1975年 Kohler和 Milstein首先利用 B淋 巴细胞杂交瘤技术制备出 单克隆抗体 （ monoclonal antibody， McAb）。 可生产有用抗体的 淋巴細胞 若与 癌细胞 融合，则形成稳定而可培养的细胞株。 癌细 胞 可培 养 生 长 浆 细 胞 B cell 可

8、分泌抗体 融 合瘤 Hybridoma YY YY Y Y Y Y Y Y Y Y YY Y YY Y 细 胞 融 合 两组 染色体混在一起 也可以培 养 生長产 生 专 一性抗 体 一個 B cell 只 产生一种抗体 一 个 B 细 胞只能生 产 一 种 抗体， 对 付某一 抗原決定基。 若有 许 多抗原決定基， 则 需 许 多株 B 細胞分別生 产许 多抗体。 B B B Y Y YY 抗 原 B Y B 亲 和力成熟 1 1 Y 2 2Y 3 3 Y 4 4 抗原決定基 1 2 34 m m mm 1 2 3 4 1 2 3 4 单 抗 细 胞融合 取出脾細胞 + 癌細胞 各抗 体 分

9、 开 单克隆抗体 单克隆抗体的应用 q作为抗体制剂，用于疾病的诊断和治疗。 q检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断 。 q放射性核素标记 单抗 进行肿瘤显像，做免疫 定位诊断。 qCD3单抗作为免疫抑制剂对器官移植免疫排 斥有抑制作用。 q以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定 向治疗。 抗体制药 McAb在免疫 导 向 疗 法中存在的 问题 A、 McAb均是鼠源性抗体， 应 用于人体内可 产 生人抗鼠抗 体（ HAMA）， 加速了排斥反 应 ，在人体内的半衰期只有 56h， 维 持有效 药 物作用靶 组织时间 ； B、 完整的抗体分子的相 对 分子 质 量 过 大， 难 以穿透 实 体

10、肿 瘤 组织 ，达不到有效的治 疗浓 度。 需要解决的 问题 A、 降低 McAb的免疫源性 ； B、 降低 McAb的相 对 分子 质 量 。 解决 问题 的方法或途径 基因工程技 术 1984年 报 道了人 鼠嵌合抗体，之后制 备 出了改型抗 体、 单链 抗体、 单 域抗体、最小 识别单 位等多种 类 型， 基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相 对 分子 质 量 只有完整抗体分子的 1/801/3。 单克隆抗体 第二节 单克隆抗体 单克隆抗体 是将抗体产生细胞与 具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融 合，通过有限稀释法及克隆化使杂交 瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产 生的。由于这种抗体是针

11、对一个抗原 决定族的抗体，又是单一的 B 淋巴细 胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。 抗体制药 抗体制药 抗体制药 -d 细 胞融合 -a -b -c -d Ag X Ag X HAT PEG Cell fusion Hybridoma cells 融合瘤 细 胞 （ Subcloning） (确 定只有一 种细 胞 ) dd a b c d a b c d + + + + + + + - X -d-c-b-a + -d NS-1骨 髓 癌 细 胞 B cell 脾 细 胞 分株培 养筛选 筛选 单 抗 传统抗体 (抗血清 ) 试验专 一性 对 抗 原 的 反 应 无 法 分 辨 完 全 不 同

12、d旧 有抗原 d新的抗原 一、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首 先要制备用于免疫的适当抗原，再用 抗原进行动物免疫。 为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物 和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行 免疫。 单克隆抗体 抗原与动物免疫 q免疫方法 ：体内免疫和体外免疫 q抗原 ：颗粒性抗原和可溶性抗原 q骨髓瘤细胞系 ：来自 BALB/c小鼠和 Lou大鼠 q免疫动物 ： BALB/c小鼠 和 Lou大 鼠 单克隆抗体 白化小鼠原种，命名为 BALB/c品系。 1985 年我国从美国引进到中国医学科学院实验动物 研究所，为 BALB/c第 180代。毛色：白化 。 主要特性 ： 乳腺肿瘤自然发生率低

13、。 易患 慢性肺炎。 对放射线甚为敏感。 与其他近 交系相比，肝、脾与体重的比值较大。 有自 发高血压症，老年鼠心脏有病变，雌雄鼠均有 动脉硬化。 对鼠伤寒沙门氏菌补体敏感，对 麻疹病毒中度敏感。对利什曼原虫属、立克次 氏体和百日咳组织胺易感因子敏感。 主要用途 ：广泛地应用于肿瘤学、生理学、免 疫学、核医学研究，以及单克隆抗体的制备等 。 BALB/c小鼠 体内免疫法 适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般 用 8 12周龄雌性鼠。 颗粒性抗原 （如细菌细胞抗原）的免疫原性强 ，可不加佐剂，直接注入腹腔 107个细胞进行初次免 疫，间隔 1 3周，再追加免疫 1 2次。 可溶性抗原 按每只

14、小鼠 10 100g抗原与福氏完 全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间 隔 2 4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫 1 2次。 一般再采脾细胞前 3日由静脉注射最后一次抗原。刺 激 B细胞分裂。 单克隆抗体 脾内免疫法 即在麻醉下直接将 0.1 0.2ml抗原注入脾脏进行免 疫。细胞抗原需 105个，可溶性抗 原需 10g 。 体内免疫 体外免疫法 用于不能采用体内免疫的情况下，如制备 人源性 McAb；免疫源性极弱，易引起免疫抑 制。 优点 ：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。 操作 ：用 4 8周龄 BALB/c小鼠的脾脏制成单细 胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达 0.5 5g/ml

15、, 在 5% CO2、 37 下培养 4 5天 , 再分离脾细胞 ,进行细胞融合。 体外免疫 二、细胞融合与杂交瘤细胞选择性培养 细胞融合的方法 脾细胞（ 110 8） 骨髓瘤细胞（ 210 7） 混合 PEG(2min) 融合 培养液稀释融合液 抗体制药 聚乙二醇（ PEG） ：融合 剂 ，相 对 分子量 4000， 浓 度 为 50%。 二甲基 亚砜 （ DMSO） ：促融 剂 ，增加融合率。 融合率高 自身不分泌抗体 产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强 长期稳定 细胞融合 骨髓瘤细胞的特点 杂交瘤细胞的筛选 细胞融合后可产生多种融合细胞： 脾 -脾、脾 -瘤、瘤 -瘤融合细胞。 利用 HAT

16、选择性培养基进行淘汰 ： 次氨甲喋呤（ A ）阻断 DNA合成 ， 淘汰瘤 -瘤细胞和瘤细胞、脾 -脾细胞 、脾细胞；而脾细胞可利用次 黄嘌呤（ H ）和胸腺嘧啶（ T ）合成 DNA，使 脾 -瘤融合细胞得以生长 。 细胞融合 细胞融合 三、筛选阳性克隆与克隆化 常用检测方法 q免疫酶技术 q免疫荧光技术 q放射免疫技术 单克隆抗体 克隆化 是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集 团的整个培养过程。 常用的克隆化方法 q有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到 96孔 板，使每孔中在理论上只含有一个细胞 。 第一次克隆化时也要应用 HT培养液，以 后的克隆化可用不含 HT的 RPMI 164

17、0培 养液。 q软琼脂法：在培养液中加入 0.5%的琼脂糖凝胶，细胞 分裂后形成小球样团块，由于培养基是半 固体状态，可用吸管吸出，移入 96孔板培 养。 单克隆抗体 ELISA用于破伤风抗体的筛选 单克隆抗体 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 杂交瘤细胞鉴定 染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数： 40，全部为端着丝粒。 小鼠骨髓瘤细胞染色体： SP2/0细胞 为 6268， NS-1为 5464， 大多数为非整倍性，有中部和亚中 部着丝点。 杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和 ， 在结构上多数为端着丝粒染色体外 ， 还应出现少数标志染色体。 染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞

18、分泌高效价 的抗体；反之，则反。 单克隆抗体 五、 单克隆抗体的大量制备 体外培养法：可获的 10g/ml抗体 体内诱生法：可获 的 5 20mg/ml抗体 降植烷 BALB/c小鼠 接种杂交瘤细胞 取腹水 离心 上清液 单克隆抗体 六、 单克隆抗体的纯化 根据 Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。 q体外诊断试剂 IgG类 沉淀处理 +亲和层析 q IgM类 沉淀处理 +凝胶过滤 q体内诊断试剂或治疗用药 亲和层析 +阴离子交 换层析。注意除去毒 素、病毒、核酸等微 量的污染物。 单克隆抗体 动物体内诱生法制备的 McAb纯化的一般程序 （ 1）澄清和沉淀处理： 1000g 离心 5m

19、in，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块 、纤维蛋白凝块和脂质） 20 000g 高速离心 30min ,去除残留的小颗粒物质 用 0.2 m微孔滤膜过滤， 去除细菌、支原体 饱和硫酸铵沉淀抗体（ 50% 饱 和硫酸铵能回收 90% 以上的抗体）。 单抗纯化 动物体内诱生法制备的 McAb纯化的一般程序 （ 2）分离 A、凝胶过滤 ：用于 IgG和 IgM类。 常用 SephadexG200 为 分离介 质 ，收集到 3个峰，最高峰 为 IgM，另外两个峰 为 IgG。 抗体回收率达 5080% ，能去除微量 杂 蛋白， 纯 度达 95% 以上。 B、阴粒子交换层析： 用于 IgG类。 在 pH7.

20、4条件下， IgG1 和 IgG2能 结 合在 DEAE填料上，其中 IgG2a可在 较 低粒子 强 度 下洗脱下来，其 纯 度很高。 IgG2b和 IgG3在低离子 强 度下易 发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。 C、亲和层析： 多用蛋白 A亲和层析，适用于 IgG类。 鼠源 性 单 抗在 pH8.0时 ， IgG2b、 IgG3几乎全部 结 合在蛋白 A柱上， IgG1稍差，用 pH3.5缓 冲液可洗脱 IgG2b， pH4.0缓 冲液可洗 脱下 IgG3， pH4.5缓 冲液可洗脱 IgG2a， pH6.0可洗脱 IgG1。收 获 的抗体 纯 度很高，但也有极微量的

21、杂 蛋白。 单抗纯化 第三节 鼠源性单克隆抗体 的改造 杂 交瘤 单 抗 为 鼠源性， 应 用人 体 产 生人抗鼠抗体及毒副作用。 对 鼠源性的 单 抗 进 行基因加工和改造 。 目的 ：降低免疫原性；降低相 对 分 子量，增加 组织 通透性。 单抗改造 Ig分子结构 单抗改造 原理 ：抗体同抗原 结 合的功能 决定于抗体 分子的 可变区 （ V） ， 同种性 免疫原性 则决 定于抗体分子的 稳定 区 （ C）。 1个 Fab片段 1个 Fc片段 Ig分子的基因结构 单抗改造 单抗改造 一、人鼠嵌合抗体 （ chimeric antibody） 在基因水平上将 鼠源 单抗的 可变区 （ V）与

22、 人 抗体抗体 的 稳定区 （ C）融合而得到的抗体。 单抗改造 构建 嵌合抗体 的大致过程是，将鼠源单抗 的 可变区基因 克隆出来，连到包含有 人抗体稳 定区基因 及表达所需的其它元件 (如启动子、 增强子、选择标记等 )的表达载体上，在哺乳 动物细胞 (如骨髓瘤细胞、 CHO细胞 )中表达。 单抗改造 构建重组表达载体构建重组表达载体 克隆鼠单抗的可变区基因，可从 基因组文 库 中分离，也可用 PCR技术 分离。 人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒 定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体 的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变 来修饰调整其效应。 人 -鼠嵌合抗体与鼠单抗相比， 免疫

23、原性 大大降低，利于在人体内应用 ，加强 ADCC效 应。目前已制备出上百种抗各种抗原 (包括肿 瘤相关抗原 )的嵌合抗体。 单抗改造 ADCC效应 即 抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。 其机制为靶细胞膜抗原与特异性 IgG类抗体 结合形成免疫复合物后， IgG抗体的 Fc段与 效应细胞 (如 NK细胞、巨噬细胞 )上的 Fc受 体结合，使效应细胞活化，产生对靶细胞的 杀伤作用。 单抗改造 鼠单抗可变区的人源化鼠单抗可变区的人源化 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很 多，但有时它仍可能引发较强的免疫反 应。为了进一步降低抗体的鼠源成分， 发展出 CDR移植技术。 CDR移植即 把鼠抗体的 CDR序

24、列移植 到人抗体的可变区内 ，所得到的抗体称 CDR移植抗体或 改型抗体 ，也就是 人源 化抗体。 单抗改造 二、改形抗体（ CDR移植抗体 ） ( Reshaping antibody ) Ig 分子中参与构成 抗原 结合部位的区域 是 H和 L链 V区中的 互补决定区 （ CDR 区），而不是整个可变区。 H和 L链各有 三个 CDR，其 它部分称框架区。 用鼠源单抗的 CDR序 列 替换人 Ig 分子中 CDR序 列，则可使人的 Ig 分子具 有鼠源单抗的抗原结合特异 性。可消除免疫源性。 单抗改造 CDR区 单抗改造 三、小分子抗体 基因工程小分子抗体 仅表达 鼠源单抗的 V 区片段

25、，相对分子量为原抗体的 1/80 1/3。即 保留 CDR区，而 Ig 分子中的 C区不表达。 小分子抗体类型有 Fab片段抗体： VH+CH1 Fv抗体： VH+VL 单链抗体 ： VH-Linker-VL 单域抗体： VH或 VL 最小识别单位（ MRU） 单抗改造 小分子抗体的优点 可以用细菌发酵生产，成本低可以用细菌发酵生产，成本低 ; 分子小，穿透力强分子小，穿透力强 ; 不含不含 Fc， 没有没有 Fc带来的效应带来的效应 ; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解在体内循环的半衰期短，易清除，利于解 毒排出毒排出 ; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得易于与毒素或酶基因连接，便于

26、直接获得 免疫毒素或酶标抗体等。免疫毒素或酶标抗体等。 单抗改造 Fv ScFv 单区抗体单区抗体 最小识别单位最小识别单位Fab 小分子抗体 由完整的 轻链和 Fd组成，大小为完整分子的 1/3 。 把 Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽作用下， Fab 进入质周腔，装配折叠后具有结合抗原的活性。 （ 1） Fab （ VH+CH1 ） 小分子抗体 Fv、 ScFv的大小约为全分子的 1/6。 （ 2） Fv（ VH+VL） 或 ScFv Fv ScFv 连接肽 小分子抗体 Fv由 VH与 VL构成，由于其结合是非共价 结合，故 Fv不稳定 。 在 VH与 VL之间加上一段连接肽，把 VH与

27、 VL连成一条单链，得到 ScFv， 即 单链抗体 。 连接肽 的长度在 10-15个氨基酸 左右，不 宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗 原性弱等特点。常用的连接肽是 (GGGGS)3。 小分子抗体 单链抗体大多在大肠杆菌中表达 直接在细胞质中表达； 与其它菌体融合表达融合蛋白； 分泌表达具有功能的单链抗体。 小分子抗体 即为 VH，约为完整分子的 1/12。它只由一 个结构域构成，故称 单域抗体 。单域抗体尽管 亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性 。 （ 3）单域抗体 （ VH或 VL ） VH 小分子抗体 约为完整分子的 1/80-1/70大小，一般由 一个 CDR构成，它也

28、保持 着抗体的特异性。 （ 4）最小识别单位 （ MRU） CDR 小分子抗体 四、双功能抗体 即双特异性抗体（ BsAb） 。它是一种 非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具有 不同的特异性。乃是一种小分子的双价双 特异性抗体片段。 单抗改造 双特异性抗体 是指能同时识别 2种抗原 的抗体。 1种为对应肿瘤相关抗原，另 1种 为对应效应成分。 即能 结合靶肿瘤细胞 又能 结合高细胞 毒性的效应细胞 ，将效应细胞富集在肿瘤 周围，而且可以模拟天然配体的作用 ,与细 胞表面引发分子结合，激活效应细胞，实 现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。 双功能抗体 双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比， 除了能 特异性识别

29、肿瘤细胞 外，还能 将循环血 液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处 ，从 而使效应细胞的抗肿瘤活性增强，发挥免疫导 向作用，这是肿瘤治疗的新突破。 双功能抗体 双功能抗体 多价小分子抗体 五、抗体融合蛋白 从广义讲应属于双功能抗体范畴。类型： （ 1）配基 配基型融合蛋白，如 CD4-Fc （ 2）配基 Ig 型嵌合抗体，如 IL-2-Ig （ 3）配基 FV 型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 （ 4）受体 FV 型融合蛋白 （ 5）酶 抗体型融合蛋白（ abeneyme，抗体酶 ） 单抗改造 第四节 基因工程抗体和抗体工程 抗体研究的三个阶段： 以 1890年 Behring发现 白喉抗毒

30、素为代表，其特点是 用抗原免疫动物来获得 多克隆抗体 ； 以 1975年 Khler创建 杂交瘤技术制备 单克隆抗体 为代表； 以 1994年 Winter 以 基因工程方 法制备抗体 为代表。通过细菌发酵或转基因动物或转 基因植物大规模生产抗体，在此基础上发展成抗体工 程。他创建了噬菌体 抗体库技术 ，克服了人体不能随 意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而 获得 人源性基因工程抗体 。 抗体制药 抗体库技术 抗体库技术是用基因工程方法把人或 其他动物的 全部抗体的轻 、 重链可变区基 因 克隆出来，在原核载体上表达，然后筛 选出所需的特异基因和抗体。 抗体工程 一、噬菌体抗体库技术的基

31、本方法 1.获取目的基因 提取 RNA，经 RT-PCR获取抗体某一特定基因区段。 2.抗体库技术的载体 普遍使用噬菌粒（ phagemid）载体。 3.淘筛（ panning） 用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，淘汰非目的克 隆，使目的克隆大量扩增。 4.表达与鉴定 目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性 表达，其产物用 Western blot 分析确定后，就完成了全过程 。 抗体工程 RT-PCR 将 RNA的反转录（ RT）和 cDNA的聚合 酶链式扩增（ PCR）相结合的技术。 抗体工程 反转录酶RNA cDNA 扩增目的片段 PCR 噬菌体抗体库的 “ 吸附一洗脱一扩

32、增 ” 富集性选择过程 二、噬菌体抗体库技术的特点 1.模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过 1011库容，能包含 B细胞全部 克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴 细胞提取的 mRNA反转录形成的 cDNA扩增，是人体多克隆 细胞的总 mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的 种属普遍性。 VH和 VL基因的随机重组增加了抗体的多样性 。 2.避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出 任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用 人工免疫动物和细胞融合技术。 3.可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库技术中， VH和

33、 VL基因的随机重组模拟 了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体 ， 因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。 抗体工程 三、基因工程抗体的表达 1.原核细胞表达 2.真核细胞表达 酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞、真菌等。 3.转基因植物表达 烟草叶和拟南芥植物。其产量可达叶片总蛋白 量的 1.3%。 4.转基因动物表达 单基因水平上做转基因鼠。 抗体工程 第五节 抗体诊断试剂 抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某 种反应。 在体内 ，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或 中和毒素等作用，故 抗体类药物可用于治疗 。 在体外 ，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀

34、 等可见反应，故可用已知 抗体来鉴定抗原 ；做病原学 诊断和血型测定，称为 血清学鉴定 。抗体诊断药物基 本分为三类：血清学鉴定用的和免疫标记技术用的抗 体制剂，以及体内导向诊断药物。 抗体制药 一、血清学鉴定用的抗体类试剂 1.鉴定病原菌用的抗体试剂 （ 1）常用诊断血清的品种和用途 见书 162页表 4 6。 抗体诊断试剂 1.鉴定病原菌用的抗体试剂 （ 2）诊断血清的制备步骤 a、 制备细菌抗原 细菌接种 培养收集菌苔 制成菌液 b、 免疫动物和制备抗体血清 动物：家兔、马、羊、 豚鼠 。 免疫途径：静脉、腹腔、皮下。 接种次数 37次，每次间隔 34d，末次 注射后 68d取 血样测效

35、价，达到要求，即可采血，离心分离血清。 c、 诊断血清的诊断方法 直接凝集反应。 抗体诊断试剂 豚鼠 2.乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂 （ 1） 试剂制备原理 ：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能 吸附蛋白质，当纯化的抗 HBs血清吸附其上时便具有抗体 活性，若待测样品中存在有 HBsAg时，则发生特异性结合 而使血细胞发生凝集。 （ 2） 制备步骤 ：先用 HBsAg免疫豚鼠 获得抗 HBs血清 硫 酸铵盐析 /柱层析 取其 IgG 在 pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛 化血细胞 洗去多余蛋白成分，用含 1% 兔血清的稀释液稀 释至一定浓度，分装即成。 （ 3） 诊断方法 ：在

36、V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，许 血细胞沉积于 V型 孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集 成块状。 单抗改造 3.妊娠诊断试剂 妇女妊娠后，血液和尿液 中的 HCG含量增高，在 3个月 内可达到高峰。此时检测尿液 中的 HCG，就可确定是否怀 孕。 单抗改造 HCG（ 人绒毛膜促性腺 激素 ） 是由胎盘的滋养层细胞 分泌的一种糖蛋白，由 a-和 b- 两个亚单位构成。 正常参考 值 妊娠周数 HCG（ IU/L） 1-2周 50-500 2-3周 100-5000 3-4周 500-10000 4-5周 1000-50000 5-6周 10000-100000 6-8周 15000-20

37、0000 2-3月 10000-100000 4.抗 ABO血型系统血清 单抗改造 原理 ：血清学方法检测 ABO血型是 根据抗原、抗体 相互作用的原理，检出能产生抗体的血型抗原。 方法 ：向新鲜血液中加入抗 A，抗 B，抗 O标准血清 ，离心、振荡、静置。细胞沉积在底部（阳性）， 不凝集孔细胞呈悬浮状态（阴性）。 二、 免疫标记技术用的抗体类试剂 给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性， 能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应 得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵 敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作 出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外， 还能为探讨发病机制提供手段。 抗

38、体诊断试剂 1.荧光抗体诊断试剂 荧光抗体是用荧光色素，如异硫氰酸荧光素 （ FITC）、罗丹明（ RB200）、藻红素（ PE）等 标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含 有抗原物质的组织切片或细胞 ，荧光抗体就与抗原 结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达 到诊断和定位的目的。 抗体诊断试剂 二、 免疫标记技术用的抗体类试剂 2.免疫酶抗体诊断试剂（酶标诊断试剂） a、 HBsAg（乙型肝炎表面抗原）酶标诊断试剂 b、 HBeAg（乙型肝炎 e抗原）酶标诊断试剂 c、 HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂 d、测定 HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂 e、 AFP

39、（甲胎蛋白）酶标诊断试剂 f、 CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂 抗体诊断试剂 二、 免疫标记技术用的抗体类试剂 酶联免疫吸附测定原理 酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA)是在免疫酶技术 (immunoenzymatic techniques) 上发展起来的一种新型免疫测定技术， ELISA过程包括： 抗原吸附在固相载体上，这个过程称为 包被 ，加待测抗体 , 再加相应酶标记抗体，生成抗原 -待测抗体 -酶标记抗体的 复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光 度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成 正比。

40、同理也可包被抗体，测定抗原含量。 ELISA最常用 的四种方法： 直接法测定抗原 ； 间接法测定抗体 ； 双抗体 夹心法测定抗原 ； 竞争法测定抗原 。 酶联免疫吸附试验直接法（测抗原） A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原 抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量抗原量。 3.放射免疫用抗体诊断试剂 把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性 两大特点结合起来建立的检测技术。能测出 ng/ml，甚至 pg/ml 水平的微量抗原物质。常用的标记抗体试剂： a、 HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂： 125I 标记，灵敏度 0.1 ng/ml b、 HBeAg放射性核

41、素标记抗体诊断试剂： 125I 标记，灵敏度 0.1 ng/ml c、 HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂： 125I 标记 d、 AFP放射性核素标记抗体诊断试剂： 125I 标记，灵敏度 15 ng/ml e、 CEA放射性核素标记抗体诊断试剂： 125I 标记，灵敏度 1 ng/ml 抗体诊断试剂 二、 免疫标记技术用的抗体类试剂 三、导向诊断药物 由于肿瘤的特异性小分子抗体 尚在研究之中，所以导向药物还未 在临床广泛应用。 抗体诊断试剂 第六节 抗体治疗药物 以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有 20多年的 历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿 瘤相关的抗原，受试病人超过

42、数千例。但治疗用的制剂 尚没有一种达到商品化的程度。在治疗药物中，单克隆 抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳，但有效率仅 30%。 目前状况 ：研究进展迅速，但未达到常规治疗的应 用阶段。 原因 ：抗体相对分子质量大，穿透力低，不能达到 靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应。 抗体制药 常用的抗癌药物 q氨甲喋呤 （ methotrexate,MTX） q阿霉素 (adriamycin,ADM) q丝裂霉素 (mitomycin,MMC) q环磷酰胺 (cyclophosphamide,CTX) q新抑癌蛋白 (neocarzinostatin, NCS) q正定霉素 (doxorubicin, DOX) 抗体治疗药物 作 业 175页 思考题： 1、 2、 3、 4、 5 补充题： 1.抗体分子的特殊性决定了抗体制药具有哪些特点？ 2.基因工程抗体与单克隆抗体相比具有哪些优越性？ 3.酶联免疫吸附法的类型及基本操作过程？ 4.抗体酶与抗体及酶相比有哪些相同点与不同点？ 5.噬菌体抗体库的应用有哪些？ 6.抗癌 药 物偶 联 的抗体 药 物用于癌症治 疗 与普通化 疗药 物 相比有哪些 优 越性？ 7.如何去除脾 -瘤以外的融和细胞？ 8.课堂上讲授过的术语和概念。 单克隆抗体 返回 总 目 录