核酸的结构.ppt

1、第二节 核酸的结构 一、核酸的一级结构 定义 核酸中核苷酸的排列顺序。 由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称 为 碱基序列 。 可以用碱基序列表示核酸的一级结构 5 端 3端 C G A 核酸的一级结构 u 核苷酸间的连接键是： 3， 5-磷酸二酯键 u 相间排列的戊糖和磷酸构成主 链，碱基是有秩序连接的侧链基团 u 线性核酸链都有一个 3-末端和 一个 5-末端 u 可以碱基序列表示核酸的一级 结构 A G P5 P T P G P C P T P OH 3 核酸一级结构的简写表示 5 pApGpTpGpCpT-OH 3 5 A G T G C T 3 核酸一级结构书写规则 用 p表示

2、磷酸基团。 p在核苷左侧时，表示磷酸与糖 环的 5 -羟基结合；在右侧表示与 3 -羟基结合。 举例： pApCpGpU pApCp GpU:表示水解后 C的 3 -羟基连有磷酸基； pApC pGpU:表示水解后 C的 3 -羟基是游离的 P可省略，用字母表示。 pACGU 简写式的读向是从左到右，碱基序列是 5到 3 二、 DNA的二级结构 -双螺旋结构 （一） DNA双螺旋结构的研究背景 碱基组成分析 Chargaff 规则： A = T G C 碱基的理化数据分析 A-T、 G-C以 氢键 配对较合理； 其他组合易相互排斥；如 G:T DNA纤维有相似的 X-线衍射图谱， 说明 DNA

3、可能有共同的空间结构。 Chargaff规则： （ 1） A=T （ 2） G=C （ 3） A+C=G+T （ 4） A+G=C+T （二） DNA双螺旋结构模型要点 （ Watson, Crick, 1953 ） uDNA分子由两条 相互平行但走 向相反 的脱氧多核苷酸链组成 ，两链以 -脱氧核糖 -磷酸 -为骨 架，以 右手螺旋 方式绕同一公 共轴盘。 u碱基对糖苷键的角度差异，使 得形成大沟及小沟相间排列。 大沟和小沟处碱基基团分布不 同，可以与蛋白质特异作用。 两个核苷酸间的夹角 36 （二） DNA双螺旋结构模型要点 u碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对 側碱基形成 氢键 配对 （互

4、补配对形式 ： A=T; GC） 。 碱基在一条链上的 排列顺序不受任何限制。但根据碱基 配对原则，一条核苷酸链序列可决定 另一条互补链的序列。 u双螺旋的直径为 2nm， 相邻碱基平面 距离 0.34nm， 螺旋一圈螺距 3.4nm， 一圈 10对碱基。 DNA分子大小常用碱 基对数（ bp）表示 碱基互补配对 TA G C 碱基平面与纵轴 垂直 ，糖环平面与纵轴 平行 （二） DNA双螺旋结构模型要点 （ Watson, Crick, 1953 ） u大多数天然 DNA属于双 链 DNA,某些病毒中 DNA 属于单链 DNA. u氢键 维持双链 横向稳定 性 ， 碱基堆积力 维持双 链 纵

5、向稳定性 。 DNA，双螺旋，正反向，互补链。 A对 T， GC连，配对时，用氢键 (AT2， GC3) 十碱基，转一圈，螺距 34点中间。 碱基力和氢键，维持螺旋结构坚。 PS: AT2， GC3：指 AT之间二个氢键， GC间三个 . 螺距 34点中间即 3.4。 DNA双螺旋结构记忆歌诀 碱基堆积力 形成疏水环境（主要因素） 。 碱基配对的 氢键 。 GC含量越多，越稳定。 磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间 形成 离子键 ，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于 DNA稳定。 碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分 子的攻击。 稳定双螺旋结构的因素 类型

6、 结晶状态 螺距 碱基距离 每圈 旋转 (nm) (nm) bp数 方向 A 相对湿度 75% 2.3 0.255 11 右手 DNA钠盐 B 相对湿度 92% 3.4 0.34 10 右手 DNA钠盐 C 相对湿度 66% 3.1 0.332 9.3 右手 DNA锂盐 Z d(GCGCGC) 4.5 0.37 12 左手 三、 DNA二级结构的其他类型 DNA单键可以旋转，所以 DNA会呈现不同二级结构类型 DNA双螺旋结构的多样性 DNA双螺旋结构的多样性 Z型 DNAB型 DNAA型 DNA DNA的其他结构类型 1.二重对称结构： 2. 一条链碱基序列的正读与另一条链 碱基序列的 反读

7、相同。（回文顺序） 3.2. 镜像重复 4. 此重复序列可能形成三螺旋 DNA结构。 5. 三螺旋结构可以阻止 DNA的体外合成。 3. 四链结构 由串联重复的鸟苷酸链构成。 4条主链平行 排列。 （一）定义 DNA双螺旋通过扭曲和折叠所形成的特定构象 。 包括： 不同二级结构单元间的相互作用 单链与二级结构单元间的相互作用 DNA的拓扑特征 超螺旋是 DNA三级结构的主要形式。 第四节第四节 DNA的高级结构的高级结构 超螺旋结构 (supercoil) DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。 超螺旋 DNA结构致密，增加了其稳定性。 正超螺旋 (positive supercoil) 盘绕

8、方向与 DNA双螺旋方向 相同 ,可增加螺 旋圈数。 DNA复制时，可在 拓扑异构酶的 作 用下消除正超螺旋的扭曲张力。 负超螺旋 (negative supercoil) 盘绕方向与 DNA双螺旋方向 相反 ，可减少螺 旋圈数。解开负超螺旋，双螺旋部分区域会形 成 单链 区。生物体内以 负超螺旋 存在 意义 DNA超螺旋结构整体或局部的拓 扑学变化及其调控对于 DNA复制和 RNA转录过程具有关键作用。 （二）环状 DNA的三种典型构象 （ 1）、 松弛环形 DNA（开 环 DNA) 超螺旋 DNA的一条链断裂，释放扭曲张力形成的 DNA （ 2）、 解链环形 DNA (线 性 DNA) 超

9、螺旋 DNA的两条链均断裂形成的 DNA （ 3）、 正超螺旋与负超螺旋 DNA 连环数 （ linking number , L） DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数 扭转数 （ twisting number , T） DNA分子中的 Watson-Crick螺旋数目，以 T表示 超螺旋数 （缠绕数 , writhing number , W） 连环 数（ L ） 缠绕 数（ T） 扭曲数 W 松 驰环 25 25 0 解 链环 23 23 0 超螺旋 23 25 -2 L=T+W （三）拓扑异构酶 改变 DNA拓扑异构体的 L值。 拓扑异构酶酶 I（解旋酶） 能使双链负

10、超螺旋 DNA转变成松驰形环状 DNA， 每次催化使 L值增加 1。 拓扑异构酶酶 II（促旋酶） 能使松驰环状 DNA转变成负超螺旋形 DNA，每次 催化使 L减少 2。 核小体由 DNA链连在一起形成念珠状结构 （四）真核生物染色体的结构（四）真核生物染色体的结构 1、染色体、染色体 真核生物染色体由 DNA和蛋白质构成，其基 本单位是 核小体 (nucleosome)。 DNA的存在形式的存在形式 核小体的组成及性质 1. 核小体的组成 DNA：在组蛋白核心外面缠绕 1.75圈（ 约 146bp ） 组蛋白： H1 H2A， H2B H3 H4 2. 核小体核心颗粒含 H2A, H2B,

11、H3和 H4各两分子 。连接核心颗粒的 DNA片段结合一分子 H1 串珠状核小体结构 染色体的形成 串珠状结构 螺线管 突环 微带 染色体（ DNA的长度压缩近 10000倍） 常染色质： 间期细胞核中压缩程度较低的， 转录活性较高的染色体 异染色质： 压缩程度较高，转录活性较低的 染色体 串珠状核小体 DNA双螺旋片段 染色质纤维 伸展形染色质片段 密集形染色质片段 整个染色体 2、序列特异性 DNA结合蛋白（ SDBP) 指染色体中含有的非组蛋白，其主要与特 异的 DNA序列结合 SDBP种类 ： 高迁移率蛋白（ HMG)、转录因子、 DNA聚合酶、 RNA聚合酶、参与基因表达 调控的蛋白

12、质、染色体骨架蛋白等 DNA的功能 DNA的基本功能是以 基因 的形式荷载遗 传信息，并作为基因复制和转录的模板。它 是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动 的信息基础。 基因从结构上定义， 是指 DNA分子中的 特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基 因的功能。 第五节 DNA和基因组 一、基因和基因组的概念 基因 ： 一段有功能的 DNA片段，生物细胞中 DNA 分子的最小功能单位（交换单位）。 DNA分子 中最小的功能单位 结构基因： 为 RNA或蛋白质编码的基因 调节基因： 只有调节基因表达的功能，并不转录 生成 RNA的基因 间隔序列： 既不转录生成 RNA，也没有调节基因 表达功能

13、的序列 基因组 ：某物质所含的全套遗传物质 二、病毒和细菌基因组的特点 1、共同点 u 基因组较小，只有一个环形或线性的 DNA分子 u 多数序列用来编码蛋白质，基因间的间隔序列很短 u 功能相关的基因常串联在一起，由共同的调控元件 调控，并转录成同一 mRNA分子，指导蛋白质合成，称 为 操纵子 。 2. 病毒基因组的特点 1）病毒基因组可以由 DNA或 RNA组成， 但每种病毒只 含一种核酸（单、双链，环形、线性）。 2）根据合成蛋白质的方式分类： 正链病毒 ： RNA进入宿主细胞后， 直接指导蛋白质的合成 负链病毒： RNA进入宿主细胞后，先合成与其碱基序列互补的 RNA, 再指导蛋白质

14、合成 双链病毒： RNA为双链，在宿主细胞中先以负链为模板合成正 链 RNA来指导蛋白质合成，随后合成负链 RNA, 构成双链 RNA， 并和蛋白质组装成新的病毒 逆转录病毒： RNA进入宿主后，在逆转录酶作用下，合成与其 互补的 DNA（ cDNA), cDNA转录生成 mRNA指导蛋白质合成。 3）重叠基因 u 一段可以编码多个肽链的核酸序列 u 重叠基因普遍存在，超过基因总量的 10% 3. 细菌基因组的特点 u 细菌染色体有一环形或线性 DNA分子，只有 一个复制起点 u 编码蛋白质的基因是单拷贝的，但 rRNA基 因是多拷贝的 u 基因组有多种调控区和少量重复序列 u 基因组中存在可

15、移动的 DNA序列（转座子） 三、真核生物基因组特点 1. 基因组较大 2. 核基因由多条线性染色体构成，每条染色体含有 一线性 DNA分子， DNA分子含有多个复制起点。 2.不存在操作子 3. 功能相关的基因组成基因簇，基因是在多种调控 因子的作用下协调表达。 3. 存在大量的重复序列 u高度重复序列 u中度重复序列 u低度重复序列 u单一序列（非重复序列） 4. 有断裂基因 u大多数为蛋白质编码的基因都含有不编码的 内含 子 和编码的 外显子 。 u内含子将基因分割成断裂基因（不连续基因） u真核生物的基因组含有大量重复序列和内含子， 外显子所占比例较小。（人类： 1.5%） 第六节 R

16、NA的结构与功能 1. 碱基组成 A、 G、 C、 U （ A U/GC） 稀 有碱基较多，稳定性较差，易水解 2. 多为单链结构 ; 少数局部自身回折形成双螺 旋（ 40%70%), 不能配对的碱基形成突环 3. 分子较小 组成特点 A-U G-C 双螺旋区双螺旋区 1.RNA通常是单链线形分子 (一级结 构 ) 2.2. 自身回折形成局部双螺旋 (二级结 构 ) 3.3. 进而折叠（ 三级结构 ） 4.4.多数形成核蛋白复合物（ 四级结 构 ） 如：核糖体、拼接体、编辑体等 。 结构特点 核糖核苷酸通过 3， ， 5， -磷酸二酯键相连 形成长链 RNA的种类、分布、功能 除了上述三种 R

17、NA外，细胞的不同部位存在的许多其 他种类的小分子 RNA，统称为 非 mRNA小 RNA(small non- messenger RNAs, snmRNAs)。 核糖体 RNA 核内不均一 RNA 核内小 RNA 细胞核和胞液 线粒体 功 能 rRNA mRNA mtrRNA tRNA mtmRNA mttRNA HnRNA SnRNA SnoRNA scRNA/7SL-RNA 核糖体组分 蛋白质合成模板 转运氨基酸 成熟 mRNA的前体 参与 hnRNA的剪接、转运 rRNA的加工、修饰 蛋白质内质网定位合成 的信号识别体的组分 信使 RNA 转运 RNA 核内小 胞浆小 RNA 细胞核

18、和胞液 线粒体 功 能 蛋白质合成模板 转运氨基酸 的前体 的加工、修饰 蛋白质内质网定位合成 的信号识别体的组分 核仁小 RNA 含量 80 5 10-15 一、转运 RNA的结构与功能 tRNA占细胞 RNA总量的 15%，在细胞 核内形成， 分子量最小； tRNA在细胞质中将氨基酸转运到核糖 体 -mRNA中，指导蛋白质合成； 细胞内有 50种以上的 tRNA； tRNA分子较小，沉降系数平均为 4S。 由 7090个核苷酸组成 含 1020% 稀有碱基 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为 G 具有 TC （一） tRNA的一级结构特点 稀有碱基 （二） tRNA的二级结构 三叶草型

19、模型 1 2 3 反密码子环 反密码子 载运氨基酸载运氨基酸 D环 TC环 可变环 四 环 四 臂D臂 氨基酸臂 反密码子臂 TC臂 氨基酸臂： 由 7对 bp组成，富含 G， 末端为 CCA，接受活化 AA 二氢尿嘧啶环（ D环） 由 8 14个核苷酸组成，含有二氢尿嘧啶核苷（ D） ，与氨基酰 tRNA合成酶的结合有关 反密码环： 识别 mRNA上的密码子 可变环： 大小是 tRNA分类的重要指标 假尿嘧啶核苷 -胸腺嘧啶核苷环（ T C环）： 含有保守的 T C顺序，可识别核蛋白体上的 rRNA, 促使 tRNA与核蛋白体结合 （三） tRNA的三级结构 倒 L形 D臂 反密码臂 氨基酸

20、臂T C臂 tRNA三级结构像倒写的字母 “L” 氨基酸臂和 T C臂同轴排列，形成 12bp的连续 双螺旋 反密码子臂和 D臂同轴排列，跟氨基臂所在轴垂直 D环和 T C环组成倒 L的转角，两环间的 氢键和 碱基堆积力 稳定了转角构象 D环， T C环和可变环中核苷酸残基形成了特定 的碱基对，稳定了 tRNA的三级结构 tRNA三级结构特点 tRNA的功能： u 结合活化氨基酸（ 3-CCA-OH ），搬运氨基 酸到核糖体 u 识别 mRNA密码子。 u 参与蛋白质的翻译。 rRNA的特点 u rRNA占细胞 RNA总量的 80% ， 分子量最大 u 核糖体由 40% 的蛋白质和 60% 的

21、 rRNA组成 u rRNA自身的构象决定了核糖体亚基的形态 u 催化肽键合成的是 rRNA u 蛋白质维持 rRNA构象，起辅助作用 二、核蛋白体 RNA的结构与功能 rRNA的功能 参与组成核蛋白体， 催化肽键的形成 。 rRNA的种类（根据沉降系数） 真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA 原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA 复杂的多环多臂结构 大肠杆菌 16s rRNA 核蛋白体的组成 原核生物（以大肠杆菌为例） 真核生物（以小鼠肝为例） 小亚基 30S 40S rRNA 16S 1542个核苷酸 18S 1874个核

22、苷酸 蛋白质 21种 占总重量的 40% 33种 占总重量的 50% 大亚基 50S 60S rRNA 23S 5S 2940个核苷酸 120个核苷酸 28S 5.85S 5S 4718个核苷酸 160个核苷酸 120个核苷酸 蛋白质 31种 占总重量的 30% 49种 占总重量的 35% 三、信使 RNA的结构与功能 结构特点： 1. mRNA占细胞总 RNA的 3%-5%， 含量最少 2. mRNA编码区的核苷酸序列决定蛋白质的氨基酸 序列 3. mRNA分子中含有非编码区 4. 大多数真核 mRNA的 5末端均在转录后加上一个 7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的 C2也是甲基 化，形成 帽

23、子结构 ： m7GpppNm-。 mRNA的帽子结构可保护 mRNA免受核酸酶从 5端的降解，并在翻译起始中起重要作用。 5. 大多数真核 mRNA的 3末端有 200多个腺苷酸 残基 的结构，称为 多聚 A尾 。 其作用在于增加 mRNA的稳定性和维持其翻译活动。 5末端帽子结构： m7GpppN 3末端有多聚腺苷酸尾巴结构 (polyA) 单顺反子（一条 mRNA链上有一个编码区） 真核生物、原核生物 mRNA一级结构特点 （ 1）真核细胞 mRNA 真核生物 mRNA的共价结构 原核生物 mRNA为多顺反子，无修饰碱基。 （多顺反子 mRNA：一条 mRNA链上有多个编码区） （ 2）原

24、核细胞 mRNA 原核生物 mRNA的 转录和翻译同时进行 ，不需剪接 和加工，直接指导蛋白质合成 真核生物先在核内合成包含内含子和外显子的 mRNA前体 ，形成分子大小不均一的核内不均一 RNA(hnRNA)。 hnRNA通过剪接和加工，转化为成熟的 mRNA, 进 入细胞质，指导蛋白质合成。 真核生物、原核生物 mRNA成熟过程的特点 hnRNA 内含子 (intron) mRNA 真核生物 mRNA成熟过程 外显 子 (exon) DNA mRNA 蛋白 转录 翻译 细胞质 细胞核 DNA 内含子 外显子 转录 转录后剪接 转运 mRNA hnRNA 翻译 蛋白 真核生物 原核生物 mR

25、NA的功能 把 DNA所携带的遗传信息，按碱 基互补配对原则，抄录并传送至核糖 体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸 排列顺序。 四、 snRNA和 snoRNA 核小 RNA（ snRNA）含量及分布 主要存在于细胞核中，含量占总 RNA量的 0.1%1% 。 snRNA存在形式及作用 usnRNA均与蛋白质相连，以核糖核蛋白的形式存在。 u在 hnRNA的剪接、细胞分裂和分化、细胞内物质运输及 构成染色体等方面起作用。 核仁小 RNA（ snoRNA)： u 位于核仁，几十 几百个碱基。 u snoRNA参与 rRNA前体的加工以及部分核苷酸的 甲基化修饰。 五、反义 RNA和 RNA干扰 反

26、义 RNA（ asRNA)的特性 u asRNA在翻译水平上抑制基因表达，还可抑 制 DNA复制和转录。 u asRNA稳定性较差。 RNA干扰（ RNAi) 利用双链 RNA抑制特定基因表达的技术。 （应用一段与 asRNA序列互补的 RNA，两者构成 双链，稳定性增强，抑制率增加） 六、非编码 RNA的多样性 高等生物的转录产物有 97% 以上是不编码蛋 白质的。 非编码 RNA（ ncRNA）：不编码蛋白质，以 RNA形式发挥作用。 1. 按 ncRNA的功能分类 u 催化 RNA（ cRNA)：核酶，有催化功能并参与 RNA的加工 u 类似 mRNA的 RNA： u 指导 RNA（ g

27、RNA): 指导 mRNA编辑的小 RNA分子 u tmRNA：既可以转运氨基酸，又可以作为模板 u 端粒酶 RNA: 作为染色体端粒复制的模板 u 信号识别颗粒（ SRP）：参与细胞内蛋白质的转运 u 微小 RNA（ miRNA): 参与基因表达和个体发育的调控 u 小干扰 RNA（ siRNA): 在 RNA干扰中介导靶 mRNA降解 ncRNA的分类 2. 按 ncRNA的分布分类 核小 RNA（ snRNA） 剪接体 snRNA U7-snRNA 核仁小 RNA（ snoRNA) 最丰富的 ncRNA, 参与 rRNA及其他 RNA的加工成熟 胞质小 RNA（ scRNA） 位于细胞质

28、，参与蛋白质的合成过程 Cajal 小体小 RNA（ CBs） 参与核糖甲基化和假尿嘧啶形成 3. 按 ncRNA的大小分类 2125nt的 ncRNA 包括 miRNA家族和小干扰 RNA家族，参与基因表 达。 100200nt的 ncRNA 参与细菌细胞的翻译调节 大于 10000nt的 ncRNA 参与高级真核生物的基因沉默 RNA既可以作为遗传物质，又可以实现蛋白 质的使命 RNA可能是 DNA和蛋白质的共同祖先； 生物进化早期可能是一个由 RNA主导的世界 核 酸 的 理 化 性 质 第 七 节 一、核酸一般理化性质 （一）核酸的水解 u 酸、碱、酶水解 u 水解位点在 磷酸二酯键

29、和 糖苷键 u DNA/RNA对酸 /碱的耐受程度有差别 碱性条件下， RNA可被稀碱水解；而 DNA 变性，但不被水解； 可用此法测定 RNA的碱 基组成或去除 RNA杂质 酸性条件下， 糖苷键 不稳定，嘌呤与脱氧核 糖间的糖苷键最易被水解；故对核酸部分水 解时，很少采用酸水解 （二）核酸的酸碱性质 1、碱基的解离 v 具有芳香环结构特点，能发生酮式 /烯醇式互变 v 碱基都具有 弱碱 性（主要是环内氨基的贡献） 2、核苷的解离 戊糖可增强碱基的解离 核糖中的羟基也可发生解离 3、核苷酸的解离 磷酸基使核苷酸具有 很强 的酸性 核酸为两性物质，通常具有较强的酸性（ 在中性溶 液中带负电荷）

30、； DNA等电点为 4 4.5； RNA等电点为 2 2.5 u DNA是白色线性高分子， 粘度极大 ； RNA为白色粉 末，粘度较小 u DNA和 RNA均微溶于水，不溶于有机溶剂，常用 乙 醇 从溶液中沉淀核酸 u 加热时， D核糖浓盐酸苔黑酚 绿色 D-2脱氧核糖酸二苯胺 蓝紫色 （三）核酸的其他理化性质 二、核酸的紫外吸收性质 u 碱基含有共轭双键，可强烈吸收 250290nm处的紫外光， 最 大吸收峰 260nm左右 u 核酸紫外吸收性质的应用 可利用紫外光照相来定位测定核酸在细胞和组织 中的分布 每摩尔碱基在一定 PH下的紫外吸收值为定值，故 利用此性质可定量碱基或碱基衍生物在纯溶

31、液中 的含量 利用碱基的紫外吸收性质可确定其在色谱和电泳 谱上的位置 载体（浅蓝色荧光）， 核酸区（暗区） 增色效应 将核酸水解为核苷酸，紫外吸收值会增 加 30%40%，这种现象称为增色效应 原因： 双螺旋结构中，碱基有规律的 紧密堆积降低了其对紫外光的吸收 1.DNA或 RNA的定量 2. OD260=1.0相当于 3. 50g/ml双链 DNA 40g/ml单链 DNA（或 41.67g/ml RNA） 20g/ml寡核苷酸 DNA浓度（ g/ml)=OD260 50; RNA浓度 (g/ml)= OD260 41.67 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品 : OD260/OD280 =

32、 1.8 RNA纯品 : OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚，比值会降低 OD260的应用 三、 核酸结构稳定性的因素 碱基堆积力 碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，碱基平面间的范德 华力和疏水作用力共同组成 碱基堆积力， 是结构稳定 的主要因素 。 碱基配对的氢键 。 GC含 量越多，越稳定。 环境中的正离子 磷酸基上的负电荷与介质中的正离子或组蛋白的正离子之 间形成 离子键 ，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有 助于 DNA稳 定。 四、 DNA的变性 (denaturation) （一）定义 ： 在某些理化因素作用下，双螺旋 区氢键断裂， DNA双链解开成两条单链 无规则线

33、团状态的过程。 变性时，某些理化因素破坏了氢键和碱基堆 积力，使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 但不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变 核酸降解：核苷酸骨架上 3， 5 -磷酸二酯键的断裂 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 DNA变性 影响核酸变性的因素： 过量酸，碱，加热 （一般 75 ） ， 变性试剂如尿素、酰胺， 某些有机溶剂（如乙醇、丙酮等） 变性后理化性质的改变： OD260增高 、粘度下降、比旋度下降、 浮力密度升高、酸碱滴定曲线改变、 生物活性丧失 RNA变性：从螺旋到线团之间的转变 RNA的变性引起的性质变化没有 DNA明显 核酸变性引起紫外吸收值的增加

34、-增色效应 DNA的紫外吸收光谱 完全变性后核酸紫外吸收值增加： v 天然 DNA 25 40%、 RNA 约 1.1% v 实质：碱基暴露 由于变性或降解引起核酸紫外吸收增加 的现象称 增色效应 OD260 : 单核苷酸 单链 DNA双链 DNA 1. 解链曲线： 如果在连续加热 DNA稀盐溶液的过程中 以温度对 A260（ absorbance， A， A260代表溶液在 260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线 。 （二）核酸的热变性及 Tm 变性过程是 “ 跃变式 ” 的，而非渐变 2. Tm： 变性是在一个相当窄的温度范围内完成 ，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的

35、50% 时的温度称为 DNA的解链温度，又称熔解 温度 (melting temperature, Tm)。其大小与 G+C含量成正比。 双链 RNA比双链 DNA稳定， Tm高大约 20 C 一般 DNA Tm 值在 85 - 90 C之间 3. 影响 Tm的因素 u G-C含量： G-C含量越高， Tm越高 经验公式 :（ G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 u 溶液的离子浓度： 浓度越低， Tm越低 u 离子溶液的 PH PH大于 11.3时，碱基不能形成氢键， DNA完 全变性； PH小于 5.0， DNA易脱嘌呤 u 变性剂： 变性剂可破坏氢键，使 Tm下降 五、 DNA的复性

36、 1. DNA复性 (renaturation)的定义 在适当条件下，变性 DNA的两条互补链可 恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为 复性 。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是 生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效 应。 减色效应 DNA复性时，其紫外吸收降低 变性和复性是可逆的， 将热变性的 DNA骤然 冷却 至低温时， DNA不可能复性。 热变性的 DNA经 缓慢冷却 后即可复性，这一 过程称为 退火 (annealing) 。 退火温度 Tm 25 2. 影响复性的因素 复性的温度： Tm 25 是合适的温度，不宜太低 单链片段的浓度： 浓度越高，碰撞频率越高，复性越快 单

37、链片段的长度： 片段越大，错配率越高，复性越慢 单链片段的复杂度： 重复序列越多，复杂度越小，越易 形成互补区，复性速度越快 溶液的离子浓度： 维持一定的正离子浓度，消除磷酸基 负电荷引起的斥力，可加快复性 六、 核酸的分子杂交 u 热变性的 DNA在复性过程中，具有碱基序列部 分互补的不同的 DNA之间或 DNA与 RNA之间形成 杂化双链的现象。这样形成的新分子称为 杂交 DNA分子 。 u 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具 有重要意义。 探针 v 探针技术： 在核酸杂交的基础上发展起来的一 种用于研究和诊断的新技术。 v 探针 (probe)： 经同位素或荧光标记的具有特 定碱基

38、序列的单链核苷酸聚合体。 v 探针可用于： 基因诊断、致病基因的定位、 Southern blotting、 Northern blotting、原 位杂交、 DNA芯片技术等临床实践和科研。 核酸分子杂交 是根据两条核酸单链在一定条件下可 按碱基互补原则退火形成双链的原理，用已知的单链核 苷酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源 核酸序列的方法。 常用的核酸分子杂交方法： Southern 印迹杂交、 Northern 印迹杂交 斑点杂交、狭缝杂交 原位杂交（菌落原位杂交、细胞原位杂交、 组织片原位杂交） 原位杂交法筛选 DNA重组体 图解 复印至硝酸 纤维素膜上 用 NaOH菌体裂

39、解 DNA变性 杂交 放射自显影 32P-cDNA 与放射性 cDNA杂 交的菌落的斑点 细菌菌落 单链 DNA结 合到膜上 Southern印迹法 DNA分子 限制片段限制性酶切割 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记 DNA探针杂交 放射自显影 带有 DNA片 段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液 转移 DNA 吸附有 DNA 片段的膜 DNA-DNA 杂交双链分子 变性 复性 不同来源的 DNA分子 核酸分子杂交的应用 研究 DNA分子中某一种基因的位置 测定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是 基因芯片 技术的基础 基因芯片技术 将相关基因的探针排列

40、在特定 芯片上，样品 DNA用荧光基团标记 后与芯片进行杂交，通过检测杂交 信号及其强度，进行基因诊断、并 可对基因序列及其功能进行大规模 、高通量的研究。 DNA芯片工作示意图 emission Laser 1 Laser 2 computer analysis DNA clones test reverse transcription Label with fluor dyesPCR amplification purfication hybridize target to microarray robotic printing reference 七、核酸酶 (Nuclease) 核酸酶

41、 是指所有可以水解核酸的酶 依据底物不同分类 uDNA酶 (DNase)： 专一降解 DNA uRNA酶 (RNase)： 专一降解 RNA u非特异性核酸酶：既能水解 DNA又能水解 RNA 依据切割部位不同 u核酸内切酶： 限制性核酸内切酶 非特异性限制性核酸内切酶。 u核酸外切酶： 53 或 35 核酸外切酶。 u参与 DNA的合成与修复及 RNA合成后的剪 接等重要基因复制和基因表达过程 u负责清除多余的、结构和功能异常的核酸， 同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 u在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 u体外重组 DNA技术中的重要工具酶 生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解 核

42、酸酶的功能 本 章 小 结 v 核酸是遗传物质载体的证明和研究历史 v 核酸的化学结构：戊糖、碱基（ A、 T、 G、 C、 U），核苷 、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号） v DNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因 组）、二级结构（ 双螺旋模型、 Z DNA等）、三级结构 （超螺旋、核小体）、结构维持的化学键 v RNA结构与功能：碱基组成特点、 RNA的种类结构及功能 v 核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交 作业一 1. 对双链 DNA而言，若一条链中 (A + G)/(T + C)= 0.7 ，则互补链中和整个 DNA分子中 (A+G)/(T+C)分别等 于多少？ 2. 维持核酸结构稳定性的因素有哪些？ 3. 作业二 1. 什么是 Tm？影响 Tm的因素有哪些？ 2. 简述 RNA的种类及其主要功能。