枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取.doc

1、目录摘要1关键词1ABSTRACT1KEYWORDS1引言11材料与方法21主要仪器和试剂2111主要仪器2112主要试剂2113主要试剂的配制312实验方法3121枯草芽孢杆菌的分离3122染色体DNA的提取4123分光光度计检测DNA纯度4124DNA的琼脂糖凝胶电泳52结果与讨论521菌株的鉴定结果522分光光度计法检测结果与分析523染色体DNA的琼脂糖凝胶电泳结果与分析524关于DNA提取过程的讨论6参考文献7致谢7枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取1枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取生物科学专业学生指导教师摘要从土壤中分离纯化并初步鉴定了一株枯草芽孢杆菌，用溶菌酶裂解该菌株，用蛋白酶K和R

2、NASEA分别水解去除蛋白质和RNA，用分光光度计检测DNA的纯度和浓度，做琼脂糖凝胶电泳，检测DNA样品的质量。结果显示，从50ML菌液中提取出10GDNA,并获得了较完整的琼脂糖凝胶电泳DNA条带。关键词枯草芽孢杆菌,染色体DNA,提取,琼脂糖凝胶电泳THEEXTRACTIONOFCHROMOSOMALDNAINBACILLUSSUBTILISSTUDENTMAJORINGINBIOLOGYSCIENCESONGYANHONGTUTORSUNXUNABSTRACTBACILLUSSUBTILISWASISOLATEDFROMSOILANDIDENTIFIEDPRELIMINARILYTHE

3、STRAINWASCATALYTICALLYDISSOLVEDBYLYSOZYME,ANDTHEPROTEINANDRNAINTHECELLWEREHYDROLYTICALLYREMOVEDBYPROTEINASEKANDRNASEA,RESPECTIVELYTHERESULTSSHOWEDTHAT10GOFCHROMOSOMALDNAOFBACILLUSSUBTILISWASEXTRACTEDOUTFROM50MLOFTHESTRAINCULTUREBYSPECTROMETRY,ANDTHEDNASAMPLEWASCOMPLETETHROUGHAGAROSEGELELECTROPHORESI

4、SKEYWORDSBACILLUSSUBTILIS，CHROMOSOMALDNA，EXTRACTION，AGAROSEGELELECTROPHORESIS引言芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年,EHRENBERG所描述的VIBRIOSUBTILIS即是现在大家熟悉的枯草芽孢杆菌,它是由COHN于1872年正式命名的,现作为芽孢杆菌科BACILLACEAE的模式菌株1。枯草芽孢杆菌（BACILLUSSUBTILIS）是芽孢杆菌属的一种，从生物学特性来讲,枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征,其细胞呈直杆状。单个细胞070823微米。着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动。枯草芽孢杆菌（B

5、ACILLUSSUBTILIS）革兰氏阳性菌，芽孢06091015微米。椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，微白色或微黄色，在液体培养基菏泽学院本科生毕业设计（论文）2中生长时，常形成皱醭。可分解淀粉，为典型的好氧菌2。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。国内外关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有100多年的历史,早期大部分工作集中在形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。近年来,对枯草芽孢杆菌研究渐进到

6、遗传学与分子生物学领域,研究内容体现在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等34。1997年,KUNSTF等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定,并将结果发表在NATURE杂志上5。随着人们对枯草芽孢杆菌研究的深入开展,发现其在工业、农业、医药卫生、食品保健、水产养殖等方面具有广泛应用价值6。生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。真核细胞的DNA主要存在于细胞核中，与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。从细菌、植物和哺乳动物细胞中提取基因组DNA可分两步先是温和裂解细胞及溶解DNA，接着采用化学或酶学的方法，去

7、除蛋白质、RNA以及其他的大分子。掌握染色体DNA的提取方法，制备高质量的基因组DNA，可用作PCR扩增的模板，还可用于构建基因文库以及进行DNA印迹（SOUTHERNBLOTTING的材料。1材料与方法11主要仪器及试剂111仪器立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；冰箱（海信北京电器有限公司）；紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；高速冷冻离心机（美国SIGMA公司）；分析天平上海精天电子仪器有限公司）；微波炉（合肥荣事达三洋电器股份有限公司）；电泳仪DYYIII5型（北京六一仪器厂）；水平板电泳槽（北京六一仪器厂）；生化培养箱HPS

8、160（哈尔滨东联电子技术公司）、80ML离心管和2ML离心管。112主要试剂TE缓冲液、GTE溶液、10SDS（M/V、酚/氯仿/异戊醇25241，氯仿/异戊醇241,体积比）、预冷的70乙醇、预冷的无水乙醇、3MOL/L醋酸钠（PH52、SC溶液、4MOL/LNACL、溶菌酶（50MG/ML，新鲜配制）、1MG/ML溴化乙锭（EB,枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取3饱和酚、异丙醇、蛋白酶K10MG/ML）、RNASEA（1MG/ML）、LB液体培养基等。113主要试剂的配制1131饱和酚溶液7取100ML新鲜酚倒入分液漏斗中，加8羟基喹啉至终浓溶度为01（M/V,溶解混匀，此时溶液呈淡黄色，

9、加入等体积的05MOL/LTRISHCLPH80缓冲液，反复混匀后，静止分层，放出下层黄色酚液，弃上层；再加入01MOL/LTRISHCLPH80缓冲液,02的巯基乙醇溶液，重复上一步；直至下层酚相的PH7678；收集下层的黄色酚液，装于棕色试剂瓶中；加入少量01MOL/LTRISHCL（PH80）覆盖在酚液的表面，置4C冰箱中保存。11321MTRISHCL缓冲液PH80在800ML水中溶解12191GTRIS碱（三羟甲基氨基甲烷，分子量12114），加入浓盐酸，调PH至所需值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。113305MEDTAPH80在800ML水中加入1861G乙二胺四乙酸二钠（分子

10、量3722）在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NAOH调节PH值至80（约20G，然后定容到1L,分装后高压灭菌。1134GTE溶液50MMOL/L的葡萄糖、25MMOL/L的TRISHCLPH80、10MMOL/L的EDTAPH80。1135LB液体培养基称取蛋白胨2G,酵母膏1G,NACL2G,蒸馏水200ML，用NAOH调PH72，分装到4个锥形瓶中，121C灭菌30MIN。12实验方法121枯草芽孢杆菌的分离（1）配制培养基配制500ML培养基，称取淀粉10G、硫酸铵1G、磷酸氢二钠05G、酵母粉025G、琼脂10G。称量好后加去离子水定容到500ML，分装到两个锥形瓶中，然后高压灭菌锅121

11、C灭菌30MIN，倒平板8。（2）配制无菌水200ML，121C灭菌30MIN后备用；另包扎好培养皿，移液管，涂布棒等用品灭菌后，烘干备用。（3）制备土壤菌悬液称取样品5G（液体样品5ML），放入装有45ML无菌水的三角瓶中，振荡10MIN，即为101的土壤稀释液。（4）取45ML无菌水4瓶，用记号笔编上102，103，104，105。（5）取101稀释液，振荡后静止2MIN，用无菌移液管吸取5ML上层细胞悬液加至装有45ML无菌水的试管中，制成102稀释液。同法一次稀释至各浓度。菏泽学院本科生毕业设计（论文）4（6）另取移液管，分别以无菌操作法吸取105，104，103的稀释液01ML，加至

12、制备好的平板上，用无菌刮刀（涂布棒）涂布均匀。（7）将培养皿倒置于恒温培养箱中，于37C，培养12天。（8）根据菌落形态特征，挑取有代表性的单菌落，在相应培养基的平板上划线，直至得到纯培养。然后对该菌落进行形态学以及生理生化反应（芽孢染色，革兰氏染色，淀粉酶水解反应观察透明圈大小）鉴定，确定为枯草芽孢杆菌后，将菌株及时转接到斜面培养基上保存。122染色体DNA的提取（1）挑取枯草芽孢杆菌菌株的1个菌落于装有50MLLB液体培养基的锥形瓶中，37C振荡培养过夜（1216H）。（2）吸取1ML的过夜培养物于离心管中，10000R/MIN，离心1MIN，收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀。（3）加入10

13、0LGTE溶液，混匀至彻底分散。（4）再加入500LGTE溶液，振荡混匀（注意不要残留细小菌块）。（5）向悬液中加入6L的50MG/ML溶菌酶至终质量浓度为1MG/ML，混匀，37C温浴40MIN。（6）在向悬液中加入6L的蛋白酶K至终质量浓度为01MG/ML，混匀，55C温浴1H，中间轻缓颠倒微量离心管数次。（7）温浴结束后向溶液中加入等体积的酚氯仿异戊醇（去除蛋白质和脂质），旋锅混匀，12000R/MIN，离心5MIN,将上清液转移到另一15ML的微量离心管中，然后再用酚/氯仿/异戊醇溶液抽提一次。（8）取上清液用等体积的氯仿/异戊醇溶液抽提一次。（9）取上清液至新的离心管中，向上清液中加

14、入1/10体积的3MOL/L醋酸钠（PH52，混匀，加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，20C静置30MIN沉淀DNA，取出，4C，10000R/MIN，离心10MIN9。（10）小心弃去上清液，用1ML预冷的70乙醇洗涤沉淀，4C，10000R/MIN离心5MIN。自然干燥除去乙醇。（11）用含有RNASEA（至终质量浓度为20G/ML的TE溶解，37C温浴40MIN，除去RNA。（12）将样品贮存于4C冰箱中。123分光光度计检测DNA纯度10取30LDNA样品，加TE缓冲液至3ML，转入分光光度计的石英比色杯中；然后分光光度计也用TE缓冲液校正零点；在260NM和280NM分别读出光密

15、度值，依据OD260,OD280以及OD260/OD280的比值检测制备的总DNA样品的浓度和纯枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取5度。124DNA的琼脂糖凝胶电泳（1）制胶称取04G琼脂糖，加入50ML1TAE缓冲液微波炉加热，冷却至60C时倒胶，凝胶凝固后,取出梳子，放入电泳槽中，并加入电泳缓冲液。（2）上样取10L,20L,30LDNA样品与上样缓冲液混合，用移液枪将DNA样品加入样品孔中。（3）电泳接通电源，当溴酚蓝染料移动到适当位置处，停止电泳。（4）剥胶染色将剥下的凝胶浸入溴化乙锭（EB,05G/ML染色液中，室温染色30MIN。然后在凝胶成像仪上观察并拍照。2结果与讨论21菌株的鉴定

16、结果菌落呈白色，边缘不规则，表面粗糙褶皱，不透明，黏稠杆状，产芽孢，长杆形；芽孢染色后，用油镜可观察到芽孢被染成绿色，菌体呈红色；革兰氏染色显微镜下观察到菌体呈蓝紫色，为阳性菌；淀粉酶水解反应时可观察到明显的水解圈。经过分离，纯化和初步鉴定，获得一株枯草芽孢杆菌，用于其染色体DNA的提取。22分光光度计法检测结果与分析本论文用分光光度法检测所提枯草芽孢杆菌染色体DNA样品的浓度和纯度，结果见表1。表1分光光度计测定结果从表1中可以看出，样品DNA的OD260/OD280的比值在1617之间，说明样品DNA的浓度纯度基本达到要求，但是此比值小于18，说明样品中可能仍存在少许蛋白质或酚，这些杂质可

17、能是导致比值偏低的原因。23染色体DNA的琼脂糖凝胶电泳结果与分析OD260OD280OD260/OD280101560093167720155009416493015600941659菏泽学院本科生毕业设计（论文）6琼脂糖凝胶电泳可用于检测所提DNA样品的质量和大小，结果见图1。123MARKER图1染色体DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱从图1中可以看出，经琼脂糖凝胶电泳后，样品DNA条带没有出现拖尾现象，说明所提DNA样品具有较好的完整性，可用做今后构建其基因文库的材料。24关于DNA提取过程的讨论本实验从枯草芽孢杆菌中提取染色体DNA，根据相关文献和实验指导书的提取方法，对枯草芽孢杆菌染色体D

18、NA进行了提取，先用溶菌酶对枯草芽孢杆菌进行裂解，溶菌酶的处理是关键，在温浴中可以振荡混匀23次，如果细菌悬浊液变清，表明溶菌酶处理效果较好，否则需要补加溶菌酶，适当延长温浴时间；然后用酚、氯仿/异戊醇进行抽提（去除蛋白质，脂类等大分子物质），再加入醋酸钠、异丙醇沉淀DNA；最后加入含有RNASEA酶的TE缓冲液进行多次沉淀洗涤，以充分溶解附在管壁上的总DNA，用加入的TE缓冲液多次、反复地洗涤DNA沉淀所在部位时，操作要轻柔，以免快速吹吸导致剪切力过大使DNA断裂。将经此方法提取出来的DNA用分光光度计测260NM和280NM处的光吸收值，并计算OD260/OD280的比值，若OD260/O

19、D280的比值大于18，说明仍存在RNA，则考虑用RNA酶处理样品；若小于16，说明样品中存在蛋白质或酚，应再用酚、氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。多次测量发现此比值均小于16，说明提取的DNA中可能仍含有大量的蛋白质。原因可能是在DNA提取过程中操作时间长，导致某些试剂的PH及性质发生了变化，而且纯化步骤少，所以未能达到理想的纯化5000BP2000BP1000BP枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取7效果，提取的DNA纯度不符合要求。在进行第二次提取之前，将所有试剂都进行重新配制，并重调PH，加入溶菌酶后并延长温浴时间，更好的裂解枯草芽孢杆菌；为了将蛋白质去除干净，加入了蛋白酶K，并增加了饱和酚

20、的抽提次数。在沉淀DNA时，将醋酸钠溶液，无水乙醇，70乙醇放入20C冰箱中预冷，并将DNA放入20C冰箱30MIN，增强DNA沉淀效果。然后将取出来的DNA用分光光度计测260NM和280NM处的光吸收值，并计算OD260/OD280的比值，多次测量此比值均大于16，说明DNA样品中蛋白质等大分子物质已基本除尽，所提取DNA的纯度符合要求。参考文献1刘志恒现代微生物学M北京科学出版社,2002P92992东秀珠,蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社,20013王红革地衣芽孢杆菌淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达J微生物学报,19973721011064冯清平,薛林贵复合诱变原生质体选

21、育耐热碱菌J微生物学报,199636630325KUNSTF,OGASAWARAN,MOSZERL,ETALTHECOMPLETEGENOMESEQUENCEOFTHEGRAMPOSITIVEBACTERIUMBACILLUSSUBTILISJNATURE,1997,3902492566惠明，窦丽娜枯草芽孢杆菌的研究进展J微生物学报，2008,36276236247卢圣栋现代分子生物学实验技术第二版M中国协和医科大学出版社，1999P66678沈萍,陈向东微生物学实验教程第四版M高等教育出版社，2007P1511529朱旭芬基因工程实验指导第二版M高等教育出版社，2010P283110环状芽孢

22、杆菌的分离鉴定和分子生物学特性的初步研究四川大学硕士论文,1992P89菏泽学院本科生毕业设计（论文）8致谢本毕业论文实验工作是在菏泽学院生命科学系教授悉心指导和严格要求下完成的。孙老师严谨的治学态度、执着的科研精神、渊博的专业知识给我以深刻的教诲和指导，让我受益匪浅。他为我们提供了很多相关的实验资料，同时也帮助我们解决了很多在实验中遇到的难题。在他的指导下，使我在巩固自己的专业知识的同时也意识到了自己的不足。在论文完成之际，向敬爱的孙老师致以最衷心的感谢实验期间和同实验室的同学共同度过，大家相互帮助，相互关心，相互学习，维持了一个很好的学习氛围和实验环境，使这次毕业论文的实验得以顺利完成，尤其是王鑫晔和陈德世同学，他们在此期间给予我的无私帮助和大力支持与鼓励。在此表示深深地谢意。在菏泽学院生命科学系所有老师的关心和指导下，我度过了生命中最重要的四年，感谢他们四年来对我的培养和教育