核酸分子杂交.ppt

1、单击此处编辑母版副标题样式 单击此处编辑母版标题样式核酸分子杂交 定义 具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或 固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过 程叫核酸分子杂交。 种类 按反应支持物可分为 固相杂交 和 液相杂交 两种： 固相杂交应用较广，包括 Southern blot、 Northern blot 、 Spot blot、 in situ hybridization等。 DNA Hybridization De- and re-nature DNA DS using temperature variation 一 . 核酸探针制备及标记 v 核酸探针（ probe）是指能与特定核

2、酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，因而可检 测样品中特定的基因序列。 探针 v根据核酸探针的来源及性质有双链 DNA、单链 DNA、单链 RNA和人工合成的寡核苷酸探针等 。用于分子杂交的核酸探针均须进行标记，带 有示踪物，与靶基因杂交后，才能检测显示出 杂交体信号。标记物有 放射性同位素 和 非放射 性同位素 两大类。 3H、 35S和 32P是三种较常用 的放射性同位素标记物，非放射性同位素标记 物较常用的是 生物素（ biotin） 、 地高辛（ digoxigenin， DIG） 和 荧光素 等。 (一 )缺口平移标记法（ Nick translation） v 原理 v 在未标记的

3、 DNA探针溶液中加入一定量的胰 DNA酶 （ DNase ）， DNA聚合酶 和 标记的三磷酸核苷。 DNase 在 DNA双链上随机切开若干个带有 3-OH末端的单链缺 口，而 DNA聚合酶 发挥 5 3核酸外切酶活性从 5-末端 标记 v 切除单核苷酸；同时又具有从 5 3的聚合作用，将标记的三磷酸核苷按 5 3方向 重新修补缺口，此新合成 DNA的两条链均匀地被掺人标记物。该法适合于各种环状或 线性双链 DNA探针标记。 标记 v试剂 v1. 10缺口平移缓冲液 v0.5 mol/L Tris-Cl(pH7.2） v v0.1 mol/L MgSO4 v v1.0 mmol/L 二硫苏

4、糖醇 (DTT) v v500 g/ml 牛血清白蛋白 (BSA) v 标记 v2. 未标记脱氧三磷酸核苷（ dNTP）溶液： dTTP 、 dCTP、 dGTP溶于 50mmol/L Tris-Cl ( pH 7.2)，终浓度为 20mmol/L。 v3. DNase （ 10ng/ml）：溶于含 50g/ml BSA、 1mmol/L DTT 、 50%（ V/V）乙二醇的 溶液。 v4. DNA聚合酶 （ 5U/l）：溶于 50mmol/L Tris-Cl ( pH 7.2)。 v5. -32PdATP： 3000Ci/mmol、 10Ci/l。 操作步骤 v1. 加样：冰浴下依次加入下

5、列试剂并混匀： v10缺口平移缓冲液 2.5l v未标记的 dNTP混合液 1.0l vDNA（ 0.51g) 5.0l v-32P dATP 5.0l vDNase （振荡混匀） 2.5l vDNA聚合酶 （振荡混匀） 0.5l v双蒸去离子水至体积 25l 操作步骤 v2. 反应：于 14 16 水浴 23小时。加 1l 0 .5mol/L EDTA（ pH8.0)终止反应。 v3. 分离：标记完毕的反应液加至 TE缓冲液平衡的 Sephadex G-50柱上（柱床体积为 0.730mm ）。加样完毕后，用 TE缓冲液洗脱，分管收集洗 脱液，每管约 200l。再每管取 5 l点样于滤纸 上

6、液闪计数。主峰为纯化的标记探针，尾峰为未 被结合的游离标记核苷酸。将主峰部分收集， 20 储存。 v 操作步骤 v 4. 结合率的计算： v v 主峰计数（ CPM） v 结合率 = x 100% v 主峰计数（ CPM） +尾峰计数（ CPM） v v 一般结合率在 20 30%。 （二） 5末端标记法 v原理 vDNA 5末端的磷酸根，用碱性磷酸酶去磷酸化， 再用 T4多核苷酸激酶将 -32P ATP的 -32P转 移到 DNA 5端的羟基上。 试剂 v1. 5T4多核苷酸激酶缓冲液 v 0.5mol/L Tris-Cl(pH 7.6） v 0.1mol/L MgCl2 v 50mmol/

7、L DTT v 1 mmol/L 精脒（ Spermidine） v2. T4多核苷酸激酶溶液（ 1U/l） v3. 碱性磷酸酶（ 2 5U/ml） 操作步骤 v1. DNA 去磷酸化：在 Eppendorf管内加 5l DNA， 25l 50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0）和 20l 碱性磷酸酶， 37 反应 30 60分钟。然 后用酸变性碱性磷酸酶，用乙醚提取。再加 1/10体积 3.0mol/L醋酸钠，用乙醇沉淀。 v2. 将 0.1mCi -32PATP放入小离心管，冻干。 v3. 转 32P到 DNA上：在含有 -32PATP的小离心 管内，依次加入 38l去磷酸的 DN

8、A， 10l 多核 苷酸激酶缓冲液， 3 l 多核苷酸激酶，在 37 反 应 30 40分钟。 v 4. 分离：加等体积饱和酚，离心 5 10分钟后，取上清液到另一个小离心管内，再 加 500l乙醚，混匀，离心，弃去上层含有残留酚溶液，加 1/10体积 3.0mol/L醋酸 钠。然后加双倍体积冷乙醇混合在 -70 中 15分钟，或 -20 中 2小时，沉淀 DNA。 操作步骤 （三）随机引物标记法 v原理 v随机引物是指含有各种可能排列组合顺序的寡核 苷酸混合物。目前实验室中常用的随机引物多是 人工合成，其长度为 6个核苷酸。标记的方法是将 双链 DNA变性成单链 DNA，再与随机引物退火杂

9、交，在四种脱氧三磷酸核苷存在下，由大 DNA聚 合酶大片段（ Klenow片段）催化，从引物的 3末 端开始按 5 3方向合成与模板 DNA互补的 DNA 链，如有 -32PdNTP或其他示踪物的掺人，就 可产生标记的 DNA探针。 原理 v随机引物是指含有各种可能排列组合顺序的寡核 苷酸混合物。目前实验室中常用的随机引物多是 人工合成，其长度为 6个核苷酸。标记的方法是将 双链 DNA变性成单链 DNA，再与随机引物退火杂 交，在四种脱氧三磷酸核苷存在下，由大 DNA聚 合酶大片段（ Klenow片段）催化，从引物的 3末 端开始按 5 3方向合成与模板 DNA互补的 DNA 链，如有 -3

10、2PdNTP或其他示踪物的掺人，就 可产生标记的 DNA探针。 操作步骤 v 1. 在 Eppendorf管中，将 TE溶解的 30100ng 纯化的双链 DNA与 1 5ng随机引物 混合（总体积不超过 14l），置沸水中变性 3分钟，再立即置冰浴中冷却； v 2. 迅速离心 10秒，使溶液聚集于试管底部，冰浴中放置； 3. 冰浴中在一微量离心管中依次加入下列试剂并 混匀： v10 Klenow 缓冲液 2.5l v10 dNTP 2.5l vKlenow 片段 1.0l v-32PdCTP 5.0l v4. 将上述混合液加入到变性模板 DNA随机引物溶 液中。 v5室温放置 3小时以上。

11、操作步骤 v 6加 1l 0 .5mol/L EDTA（ pH8.0)终止反应，并用 TE缓冲液稀释反应液至 100l ， 20 保存备用。 操作步骤 （四）光化生物素法 v 原理 v 光化生物素是一种化学合成的生物素衍生物，分子中含有可光照活化的叠氮代硝苯基 ，生成活泼 N基团，后者易与 DNA或 RNA中的伯胺基发生结合反应，生成光化生物素 标记核酸探针。 v 材料 v 1. 光化生物素：在暗室中用灭菌双蒸水配成 1mg/ml，分装后，避光下 20 可稳定 保存 4 6个月。 v 2. 正丁醇或仲丁醇 v 3. 特种光源： LYQ12-100卤钨灯 操作步骤 v1. 暗室安全灯下，在 Ep

12、pendorf管中加入 1 25g待标记核酸（ 0.5 1.0g/ml DNA或 RNA），两倍量的光化生物素（即 2 50g） ，补水至 50l。将反应管敞开插入冰模中，距卤 钨灯光源 10cm，强光照射 30分钟。加 100l TE 缓冲液。此后操作在正常光线下。 v2. 加 100l正丁醇（或仲丁醇），抽提两次，去 上层正丁醇； v 3. 加 1/10体积 3mol/L醋酸钠（ pH5.2）和 2倍体积冷无水乙醇，混匀后置 20 过 夜。 v 4. 离心的沉淀经干燥后，溶于适量的 0.1mol/L EDTA或灭菌双蒸水中，浓度为 50g/ml，分装后 20 避光保存。 操作步骤 （五）

13、DIG标记探针 vDIG标记是德国 Boehringer Mannheim公司发 展的一种非放射性标记方法。 Digoxigenin- 11dUTP可以通过随机引物标记结合到 DNA探针 或通过 DNA体外转录标记到 RNA探针，或通过 3 尾端标记结合到寡聚核苷酸探针。然后与抗地 高辛抗体（ antidigonigenin alkaline phosphatase）进行免疫反应，通过化学呈色检 测。 DIG标记法与前述同位素酶促标记法基本相 同。 二 . 斑点杂交 v原理 v将 DNA或 RNA变性后直接点样吸附于固相支持滤 膜上，然后用标记探针与之杂交，洗涤去除未反 应探针，采用放射自显影

14、或显色反应检测显示杂 交信号，分析结果。 v本节主要介绍用 -32 P标记 DNA探针及光化生物 素标记 DNA探针检测 DNA与 RNA的斑点杂交方法 。 材料 1 器材 v 同位素探测仪 v 自动光密度扫描仪 v 真空抽滤加样器 v X光胶片盒（带增感屏） 2. 试剂 v 20SSC（ 3mol/L NaCl、 0.3mol/L柠檬酸 三钠）：称取 175.32g NaCl，加 700ml双蒸 水，充分溶解后，加 88.2g 柠檬酸三钠，溶解后 加双蒸水至 1000ml， 8磅高压灭菌 15分钟。 v 去离子甲酰胺：称取 11g离子交换树脂（ Bio- Bad AG 501-X8， 202

15、5目）与 110ml甲酰胺 混合，室温下搅拌 30分钟，用 Waterman滤纸过 滤 2次，分装后 20 保存。 v 胰腺癌饮食： yixianaijx/a/yixianaiyingshi/ v 硫酸葡聚糖（ 1mg/ml）：称取 1mg硫酸葡聚 糖干粉，溶于 1ml灭菌水， 20 保存。 v 50Denhardt溶液（ 1%BSA、 1% PVP-40 、 1% Ficoll-400）：分别称取 1g BSA， 1g PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）， 1g Ficoll-400（ 水溶性聚蔗糖），用少量双蒸水溶解混合，加双 蒸水至 100ml。过滤除菌， 20 保存。 2. 试剂 v 变性

16、鲑鱼精 DNA（ 10mg/ml）：称取鲑鱼精 DNA（ Sigma， 型，钠盐） 10mg放入灭菌管 中，加入 100mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L EDTA缓冲液 1ml，用超声波处理至液体透亮，完 全溶解，分装后 20 保存。临用前置沸水浴中 3分钟，然后迅速在冰浴中冷却。预杂交液中应含 100g/ml DNA经变性并打断的鲑鱼精 DNA。 v 卵白素 -碱性磷酸酶（ Avidin-AKP， 100U/100l）：以 0.4% Triton X-100 PBS液 配制。使用液中 Avidin-AKP浓度为 12U/1ml 。 2. 试剂 v 底物缓冲液： 100mmol

17、/L Tris-Cl（ pH9.5） 、 1mol/L NaCl、 5mmol/L MgCL2。 v 底物显色液 v1） 50mg/ml BCIP： 10mgBCIP溶于 200l 二甲基酰胺。 v2） 75mg/ml NBT： 15mg NBT溶于 200 l 70%二甲基酰胺（ H2O配制）。 v3）底物显色液： 5ml 底物缓冲液 + 10l BCIP + 10l NBT 2. 试剂 操作步骤 v -32 P标记 DNA探针的斑点杂交 v 1. 样膜的制备 v (1)、核酸样品的预变性 v 所取 DNA及 RNA样品的量视情况而定，一般可加 10 20g。 v 1） DNA样品：样品 D

18、NA溶于水或 TE缓冲液，置沸水浴 5 10分钟，并于冰浴中迅速 冷却，使其变性。 v 2） RNA样品：在 Eppendorf 管加入下列试剂： v RNA样品 10 l v 20 SSC 2 l v 甲醛 7 l v 甲酰胺 20 l v 混匀置 68 温育 15分钟，并迅速入冰浴中至少 5分钟。 操作步骤 v (2) 尼龙膜的预处理：戴上干净手套，取尼龙膜按需要剪成合适大小，并剪掉一角作为 点样顺序标记。如采用手工点样，用铅笔在尼龙膜上按 0.8 1cm2的面积标上小格。 用蒸馏水浸湿，再浸入 6SSC溶液中至少 30分钟，将膜取出自然凉干后待用。 操作步骤 (3)点样 v 可根据情况选

19、用手工直接点样或用真空抽滤加样器点样。 点样 v 1)手工直接点样：用微量移液器将经变性处理的核酸样品依次点到尼龙膜的标记点上 。斑点直径不要过大，应控制在 0.5cm2以内。单个样品分少量多次点样，边点样边风 干。 点样 v2)斑点（狭缝）真空抽滤加样器点样： 常规方 法清洗加样器后，用 0.1mol/L NaOH清洗点样 器，灭菌三蒸水充分冲洗，如为 RNA样品则还应 用 DEPC处理的水充分冲洗。 将尼龙膜湿润后 覆盖在加样器支持垫上（或为预先湿润的滤纸） ，小心排除气泡，尼龙膜覆盖不到的部分需用 Parafilm膜封闭；重新安装好加样器，接通真空 泵。 加样孔内加满 10SSC，真空抽

20、滤至所有 液体被抽干；关闭真空泵，然后重复抽滤一次。 点样 v 上述经预变性处理的样品中加入 2倍体积 20SSC，分别加至各孔，真空抽滤。 待 全部液体抽干后，再加 10SSC抽滤两次。待 10SSC抽干后再维持真空 5分钟，使 尼龙膜干燥。 点样 v (4)固定：点样后的样膜，置滤纸上，室温自然干燥，然后 80 烘烤 2小时固定核酸样 品。固定的样膜封存于塑料袋内待用（ 20 可保存若干月）。 2. 预杂交 v (1)配制预杂交液：终浓度为 6SSC、 50% 去离子甲酰胺、 5Denhardt液、 0.5mg/ml鲑 鱼精 DNA和 0.5% SDS。 v(2)将封存样膜的塑料袋剪一斜角

21、开口，加少量的 2SSC使其湿润，弃余液。按 150 200l/ cm2膜，加入预杂交液，去除袋内气泡，熔封塑 料袋斜角开口处。将此塑料袋置恒温摇床或杂交 炉中， 42 温育 2 4小时。 3. 杂交 v(1)探针变性： -32P标记的探针如为双链 DNA，则需 经变性处理。将标记好的探针置沸水浴中 5分钟，然后 迅速置冰浴中。 v(2)配制杂交液：终浓度为 6SSC、 50%去离子甲酰 胺、 5Denhardt液、 0.1mg/ml鲑鱼精 DNA、 0.5% SDS和放射性同位素探针 0.5ng/l。 杂交 v (3)杂交：从水浴中取出塑料袋，剪去一角，弃预杂交液，加入杂交液（按 80l/c

22、m2 膜）及 -32P标记探针。小心排除气泡，重新封好口。为防止污染，应将塑料袋外再套 另一塑料袋。将杂交袋置恒温摇床或杂交炉中， 42 温育 16 20小时。 4. 洗膜 v杂交温育结束后，剪开杂交袋一角，将杂交液 倒入放射性废物容器中，剪开袋取出膜，放进 装有 2SSC0.1%SDS 的盘中，室温摇晃漂 洗 5分钟。根据需要选择不同方法洗膜，去除 非特异性的同位素。 洗膜 v (1)高严谨性漂洗：依次按下列条件漂洗： v 2SSC0.1% SDS 室温， 215分钟； v 0.1SSC0.1% SDS 室温， 215分钟； v 0.1SSC0.1% SDS 55 ， 215分钟； 洗膜 v

23、 (2)低严谨性漂洗：依次按下列条件漂洗： v 6SSC0.1%SDS 室温， 215分钟； v 2SSC0.1% SDS 室温， 215分钟； v 1SSC0.1% SDS 55 ， 215分钟。 5. 放射性自显影 v样膜经漂洗后，置干净滤纸上，吸去膜上多余水 分，外面裹一层保险膜。暗室安全灯下，在胶盒 中压上 2张 X光胶片，样膜上下各 1张，盖上胶片 盒 80 放射自显影。时间视杂交强度而定， 24 小时 10天不等。取出胶片盒，恢复至室温。按 常规冲洗 X光片：显影 1 5分钟 ,停显 1分钟 ,定 影 5分钟 , 流动水冲洗 10分钟，自然干燥。 6. 结果观察 v 根据曝光点（或

24、狭缝）的有无、强弱，可以判定目的基因的有无及量的多少。利用 “自 动灰度扫描仪 “扫描曝光点（狭缝），计算积分光密度值，可以进行半定量分析。 （二）光敏生物素标记 DNA探针的点杂交v1. 样膜的制备 v按 -32 P标记 DNA探针的斑点杂交方法进行。 v2. 预杂交 v按 -32 P标记 DNA探针的斑点杂交方法进行。 v预杂交液中各组份的终浓度为： 5SSC、 50% 去离子甲酰胺、 5Denhardt液、 50mmol/L Na2HPO4（ pH7.0）、 5mmol/L EDTA、 0.5mg/ml鲑鱼精 DNA。 3. 杂交 v (1)探针变性：将标记的光化生物素 DNA探针加入

25、0.5ml Eppendorf管中，置沸水中 5 10分钟，立即置于冰浴中，使保持单链状态。 杂交 v (2)配制杂交液：各组分终浓度为 5SSC、 50%去离子甲酰胺、 1Denhardt液、 20mmol/L Na2HPO4（ pH7.0）、 5%硫酸葡聚糖、 0.1mg/ml鲑鱼精 DNA、光敏 生物素标记 DNA探针 20 100ng/ml组成。 杂交 v (3)杂交：参见 -32 P 标记 DNA探针的斑点杂交。 4. 洗膜 v 取出样膜置含 2SSC 0.1%SDS 溶液中漂洗 5分钟。再按下列条件洗膜： 2SSC 0.1%SDS 100ml，室温， 320分钟； 0.1SSC0.

26、1%SDS 100ml ， 65 ， 330分钟；将样膜置干净滤纸上，室温自然干燥，封入塑料袋内（不立即显色可存放 于 20 至少 1个月）。 5. 显色 v (1)封闭：将 3%BSA溶液加入塑料袋内，于 42 温育封闭 1小时。 显色 v (2)酶联显色反应：弃封闭液，再加入适当稀释的 Avidin-AKP，置室温 15 30分钟 ，不时轻微振荡。随后依次按下列条件洗膜： 100mmol/L Tris-HCl（ pH7.5）、 1mol/L NaCl； 100mmol/L Tris-HCl（ pH9.5）、 1mol/L NaCl、 5mmol/L MgCl2。将膜转入新塑料袋中，加入新配

27、制的底物显色液，在暗环境中室温下显色， 时间 15 60分钟。 6. 结果判定 v 出现蓝紫色斑点（狭缝）者为阳性，未着色为阴性。根据着色的深浅可以判定目的基 因的多少。 三 . Sourthern印迹杂交 v原理 vSourthern印迹杂交是分析 DNA的一种方法，从 细胞或组织中提取高分子量的 DNA，用一种或多 种限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳按大 小分离所得片段，从凝胶中按原来位置和顺序吸 印转移到固相支持膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜） 上，然后再与同位素或非同位素标记探针杂交， 最后经放射自显影或显色反应进行检测。 v 以 -32 P标记 DNA探针检测 DNA为例，介绍 Sou

28、rthern印迹杂交方法。 材料 v （一）器材 v 同位素探测仪 v 自动光密度扫描仪 v 真空核酸转移装置 v 紫外照相装置 v X光胶片盒（带增感屏） v v（二）试剂及配制 v1. 0.2mol/L HCl v2. 变性液 : 0.5mol/L NaOH v 1.5mol/L NaCl v3. 中和液 : 1mol/L Tris-Cl（ pH7.4） v 1.5mol/L NaCl v4、转移液 : 20SSC；或 20SSPE v5、 1mol/L Tris-Cl（ pH7.5） 1.5mol/L NaCl 操作步骤 v（一）琼脂糖凝胶电泳分离基因组 DNA限制性酶 切片段 v1、在

29、灭菌 Eppendorf管中依次加入下列试剂并 混匀（以常用的 30l反应体积为例）： v0.5g /l基因组 DNA 20l v双蒸去离子水 5l v10缓冲液 3l v限制性内切酶（ 10U/l） 2l v 2、 12 000g 离心数秒，使管壁上的液珠离心至管底，以保证反应体系体积准确。 v 3、置 37 水浴保温 36小时。 v 4、加入 1/5体积的 0.5mol/L EDTA终止反应。 v 5、依常规方法进行 DNA的琼脂糖凝胶电泳。 v （二） DNA的转移与固定 v 基因组 DNA经限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳后，可将 DNA从凝胶中转移至固相 支持膜上，方法主要有毛细管洗

30、脱法及真空转移法。 v 1、毛细管洗脱法 v （ 1）电泳结束后照相，然后切去凝胶的边角作为标记。 v （ 2）将胶置于 0.2mol /L HCl中处理 10分钟，如果检测的 DNA片段 1kb，可适当延长时间（ 1020分钟）。当胶中溴酚蓝由蓝转成桔黄 时，说明胶已处理完成。 v（ 3）弃去 HCl溶液，用去离子水漂洗 2次。随后 浸泡于数倍体积的变性液中 1545分钟后（此时 溴酚蓝重新变为蓝色），换用中和液处理 1530 分钟。 v（ 4）取一瓷盘，加入转移液，上置一块略大于凝 胶的玻璃板作为平台，玻璃板表面铺一张新华二 号滤纸，滤纸的两边浸没在转移液中，去除玻璃 板与滤纸之间的所有大

31、小气泡。 v （ 5）根据胶的大小载剪固相支持膜及滤纸片（ 35张），同样剪去膜的一角作标志（ 也可用铅笔在膜下端写上有关资料，如时间、样品及所用酶等）。 v （ 6）将膜平铺在去离子水表面，直到滤膜从下到上湿透为止，然后将其转至转移液中 ，至少 5分钟。操作时戴手套，用平头镊。 v（ 7）将经转移液浸泡的滤纸片 1 2张铺到转移 台上，驱逐气泡。倒上少许转移液，用大小适合 的薄塑料板将胶从中和液中托起，将加样孔先接 触转移台，自一端起将胶滑放到滤纸上，注意不 要留下气泡。将浸泡好的膜放在胶上，使膜的上 端对齐加样孔。放上 2 3层预先浸泡过转移液 的滤纸片，放上吸水纸堆至 10 15cm高，

32、上面 加一块平板，然后压上 0.5kg左右的重物。 v （ 8）转移持续 8 24小时，每当纸巾浸湿后更换新的纸巾。小片段转移快，大片段 转移需要时间较长。 v （ 9）转移完毕，移去吸水纸，用平头镊将膜取出，在 6SSC溶液中浸泡滤膜 5分钟， 用滤纸印吸干后，夹在两层干净滤纸片中，置于 80 烤 0.5 2小时。封入塑料袋中 保存备用。 v 2、真空转移法 v （ 1）安装真空转移装置 v 1)根据胶的大小做好塑料膜窗口，其大小略小于凝胶，每边应有 3 10mm的重合， 让胶将窗口严密地封住。但不能大于 10mm，否则加入液体后，胶容易漂起来。 v 2)将多孔滤板安放在装置的下槽内，四边套

33、紧气密圈，再放上塑料膜窗口。 v 3)将上框放上，压住窗口塑料膜的四边，夹紧四角上的锁定夹。 v（ 2）依次放上转移膜及琼脂糖凝胶 v1)膜的准备：将硝酸纤维素膜或尼龙膜裁剪成每 边少于窗口边缘 0.5 1.0mm。 v2)用水浸湿，再用 20SSC漂浮转移膜 20 30 分钟，尼龙膜可不预处理。 v3)将膜放在窗口内，务使每边留下 1mm左右的 空隙。 v4)用一张大小合适的薄塑料片托住凝胶，将加样 孔与窗口对齐平放，然后使胶滑落在膜上，覆盖 住窗口。 v 5)启动真空泵，使凝胶吸压在膜和塑料窗口上，检查密封效果。 v （ 3）脱嘌呤处理：用巴氏吸管加 0.2mol /L HCl于凝胶上，使

34、覆盖整个凝胶，使真 空泵负压在 20 30Mbar维持 10 20分钟，至溴酚蓝完全变色为止。吸去凝胶上面 的 HCl。 v （ 4）变性处理：同法加入变性液覆盖整块凝胶，使真空泵负压在 2030Mbar维持 10 20分钟，至溴酚蓝颜色完全复原为止。吸去凝胶上面的变性液。 v（ 5）中和处理：同法加入中和液覆盖整块凝胶， 使真空泵负压在 20 30Mbar维持 10 20分钟 ，吸去凝胶上面的中和液。 v（ 6）转移：从凝胶中央小心加入 20SSC溶液 ，直至覆盖住整块凝胶，液面最好达 2倍凝胶的厚 度。真空负压为 50 55Mbar，转移时间依照凝 胶的厚度、浓度而定，凝胶的厚度和浓度越高

35、， 所需时间越长，一般持续转移 30 60分钟。 v （ 7）固定：转移结束，依次移去上框、剩余的 20SSC、凝胶及真空垫圈，取出转移 膜，不要浸泡或冲洗，转移面朝上放在滤纸上晾干。将膜夹在两层滤纸中间， 80 干 烤固定 1 2小时，封入塑料袋中保存备用。 v （三）预杂交、杂交、洗膜、放射自显影和结果分析 v 按 -32 P标记 DNA探针的斑点杂交方法进行。 Diagnosis of Sickle-Cell Anemia 四 . Northern印迹杂交技术 v原理 vNorthern 印迹杂交的基本原理是将 RNA样品通 过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到尼龙 膜等固相膜载体上，

36、用放射性同位素标记的 DNA 或 RNA特异探针对固定于膜上的 mRNA进行杂交 ，洗膜去除非特异性杂交信号，经放射自显影， 对杂交信号进行分析。将杂交的 mRNA在电泳中 的迁移位置与标准分子量进行比较，即可知道细 胞中特定的基因转录产物的大小，对杂交信号的 强弱比较，可了解该基因表达 mRNA的强弱。 v 以甲醛琼脂糖变性胶电泳分离 RNA，介绍 RNA Northern印迹杂交。 v材料 v （一）器材 v同位素探测仪 v自动光密度扫描仪 v真空核酸转移 v紫外照相装置 vX光胶片盒（带增感屏） v （二）试剂及配制 v 1、 5甲醛电泳缓冲液 v 0.1mol/L 3-N-玛琳 （ N

37、-morpholincpropane-sulfonic acid， MOPS）（ pH7.0） v 25mmol/L NaAC v 5mmol/L EDTA（ pH8.0） v 将 20.9g MOPS溶于 800 ml经 0.1%焦炭酸二乙脂（ DEPC ）处理的水中，加 8.3ml 3mol/L乙酸钠， 20ml 0.5mol EDTA (pH8.0)，用 DEPC处理的水定容至 1L， 0.2m微孔滤膜过滤除菌，避光保存于 4 。溶液见光变为深黄色不能再用。 v2、甲醛凝胶加样缓冲液 v50% 甘油 v1mmol/L EDTA（ pH8.0) v0.25% 溴酚蓝 v0.25% 二甲苯青

38、 FF v用 0.1 % DEPC 37 处理过夜，高压灭菌，保 存于室温。 v3、溴化乙锭溶液 v0.5g/ml 溴化乙锭 v0.1 mol/L 乙酸铵 v 方法 v （一）甲醛变性电泳分离 RNA样品 v 1、电泳槽的无 RNA酶处理：电泳槽用去污剂洗干净，蒸馏水冲洗，无水乙醇漂洗干净 ， 3% H2O2处理 10分钟，最后用 DEPC处理过的三蒸水冲洗数遍。 v 2、配制 1%琼脂糖变性胶： v 5甲醛电泳缓冲液 20ml v 0.1%DEPC水 80ml v 琼脂糖 1g v 加热至胶完全溶化后，冷却至 60 ，加入 5.4ml 37%甲醛，混匀并置通风橱内，将凝 胶倾倒入电泳槽上，于

39、室温放置 30分钟或更长时间，使凝胶凝固。 v 3、 RNA样品处理 v 在 Eppendorf 管中加入下列试剂： v RNA样品 9 l v 5甲醛电泳缓冲液 4 l v 甲醛 7 l v 甲酰胺 20 l v 总体积 40 l，混匀后 65 温育 15分钟，并迅速置冰浴中至少 5分钟。 5000g离心 5 秒使管内所有液体集中于管底。加 4l甲醛凝胶加样缓冲液混合待用。 v4、电泳：制备的凝胶先预电泳 5分钟，再将样品 加至凝胶加样孔中，同时加入已知大小的 RNA混 合物作为分子量标准参照物，按 3 4V/cm电压 进行电泳。电泳过程中，每隔 1 2小时，将正 负极槽内液体混合后继续电泳

40、。 v 5、电泳结果观察：电泳结束后（溴酚蓝迁移出约 7 8cm），切下分子量标准参照 物的凝胶条，浸入溴化乙锭溶液中染色 30 45分钟。在凝胶旁放置一透明尺，在紫 外灯下照相，便于以后测量照片上每个 RNA条带至加样孔的距离。以 RNA片段大小的 对数值对 RNA条带的迁移距离作图，绘制标准曲线，根据标准曲线计算杂交后所检出 的 RNA分子的大小。 v （二）变性 RNA转移至尼龙膜 v 上述经甲醛琼脂糖变性凝胶电泳分离的 RNA样品，应尽快转移至尼龙膜上，方 法主要有毛细管洗脱法及真空转移法。 v 1、毛细管洗脱法 v （ 1）凝胶的预处理：将凝胶移至一个干烤过的平皿内，将边缘多余部分用

41、眼科解剖 刀切去，在加样孔一侧切去一角作凝胶方位标记。并用经 DEPC处理的三蒸水淋洗数次 ，除去甲醛。 v （ 2）取一瓷盘，加入 20 SSC溶液，上置一块略大于凝胶的玻璃板作为平台，玻璃 板表面铺一张新华二号滤纸，滤纸的两边浸没在 20 SSC溶液中，去除玻璃板与滤纸 之间的所有气泡。 v （ 3）把凝胶底向上翻转覆盖在滤纸上，去除二层之间出现的气泡。用保鲜膜围绕在凝 胶周边，但不覆盖凝胶，作为屏障以阻止液体自池边直接流至凝胶上方的纸巾中。 v （ 4）裁剪一张尼龙膜，其长与宽大于凝胶 1 1.5cm，并剪下一角做记号以定滤膜 方位。先将膜在 20 SSC中至少润湿 20分钟，然后放置在

42、凝胶表面上，二层之间不可 有气泡存在。 v（ 5）将两张与尼龙膜一样大小经 20SSC溶液 润湿过的滤纸，覆盖在尼龙膜上，去除气泡。 （ 6）把一叠约 5 10cm高同滤纸大小一样的吸水 纸放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和 约 500g的重物。 v （ 7）上述程序就绪， RNA转移即开始进行， 需持续 18 24小时。如果吸水纸过于潮湿，应 换新的吸水纸。 v （ 8）转移结束后，揭去凝胶上方的吸水纸和滤纸，取出尼龙膜，不必冲洗、浸泡，转 移面朝上置一张滤纸上晾干。将膜夹在两张滤纸中间， 80 干烤固定 1 2小时，封 入塑料袋中保存待用。 v 2、真空转移法 v （ 1）凝胶的预处

43、理：具体程序同毛细管洗脱法。 v （ 2）真空转移槽预处理：常规去污剂清洗，三蒸水漂洗数次，再用 DEPC处理的三 蒸水冲洗数次后备用。 v （ 3）在转移槽的支持网上置放经 2 SSC湿润过的新华二号滤膜二张，去除支持网与 滤膜间的气泡。 v （ 4）裁剪一张尼龙膜，每边应比凝胶大 1 1.5cm，于 2SSC中浸泡 20分钟，平 放在滤纸上，去除所有气泡。 v（ 5）选取合适大小的真空垫圈（每边略小于凝胶 1 1.5cm），覆盖住尼龙膜，调整尼龙膜的位 置，使其处于真空垫圈的中间。 v （ 6）将凝胶放置到真空垫圈上，检查凝胶四 边，要与垫圈严密重叠。排除所有气泡。 v （ 7）加上上框，

44、固定真空垫圈。打开真空泵 ，调整到 6 13kPa的压力。 v （ 8）小心加入 20SSC溶液覆盖凝胶，持续转移 3小时。 v （ 9）转移结束，依次移去上框、剩余的 20 SSC、凝胶及真空垫圈，取出尼龙膜 ，不要浸泡或冲洗，转移面朝上放在滤纸上晾干。将膜夹在两层滤纸中间， 80 干烤 固定 1 2小时，封入塑料袋中保存待用。 v （三）预杂交、杂交、洗膜和放射自显影 v 按 -32 P 标记 DNA探针的斑点杂交方法进行。 v （四）分析结果：根据曝光显示的条带，对照 RNA分子量标准参照物条带的迁移距离 图，即可查出凝胶电泳中相应的 RNA位置，从而知道基因转录的 RNA的大小。利用自

45、 动光密度扫描仪扫描曝光的条带，计算条带的积分光密度值，以内参照 RNA条带的积 分光密度为校正值，可以确定不同样品基因转录的表达强度。 五 . 原位杂交 v 原理 v 原位杂交（ in situ hybridization, ISH）是 将分子杂交与组织化学相结合的一项技术 ,也称原 位杂交组织化学（ in situ hybridization histochemistry， ISSH）。它是利用标记的 DNA或 RNA为探针，在组织、细胞及染色体上检 测特异的 DNA或 RNA序列的杂交技术。其基本原 理是含互补顺序的标记 DNA或 RNA片段即探针， v在适宜的条件下与细胞内特定的 DN

46、A或 RNA形成 稳定的杂交体。根据所用的探针和靶核酸的不同 ，原位杂交可分为 DNA-DNA杂交、 DNA-RNA杂 交和 RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是 否能直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间 接法两类。直接法指用放射性同位素、荧光素或 一些酶标记的探针与组织细胞内靶核酸所形成的 杂交体可分别通过放射自显影、 v荧光显微术或显色的酶促反应等直接检测。间 接法指用半抗原标记探针，而探针与组织细胞 内靶核酸形成的杂交体则通过免疫组织化学法 对半抗原的定位间接地显示。 v本节主要介绍用 -32P标记 DNA探针检测冰冻 组织切片中 DNA及以地高辛标记 DNA探针检 测石蜡包埋组织切片中 DNA的原位杂交方法。 v试剂 v 1、 0.2mol/L HCL： 1.72ml浓 HCL，加 ddH2O至 100ml。 v 2、 0.2%Triton X-100 0.1mol/L PBS： 1000ml 0.1mol/L PBS 液中加入 Triton X-100 2ml，混匀，高压灭菌。 v3、蛋白酶 K溶液 : v 1 mol/L Tris-HCl（ pH 8.0） 10ml v 0.5mol/L EDTA ( pH 8.0） 10ml v 加灭菌水至 100ml v使用前加入蛋白酶 K储存液（ 0.5mg/ml， -20 保存），使蛋白酶 K的终浓度为