1、1 LPEMSZYA-43-2011 生活饮用水中耐热大肠菌群、总大肠菌群、 大肠埃希氏菌的测定 酶底物法 一、实验原理 该革新的检测技术利用分别由大肠菌群 -半乳糖苷酶及大肠杆菌 -葡萄 糖醛酸酶代谢的两种营养剂指示剂：邻硝基苯-D-半乳派喃糖 （ONPG）及甲基香豆基葡糖醛酸苷（MUG），作为 Colilert 试剂的主要碳源。 1、利用大肠菌群细菌能产生 2 半乳糖苷酶分解 ONPG 使培养液呈黄色， 检测大肠菌群； 2、利用大肠埃希氏菌产生 2 葡萄糖醛酸酶分解 MUG 使培养液在波长 366nm 紫外光下产生蓝色荧光，检测大肠埃希氏菌； 3、改变培养温度，可检测耐热大肠菌群。 因为大
2、多数非大肠杆菌属菌类没有这些酶，所以无法在 Colilert 试剂里 生长及干涉这些物质。而有这些酶的少数非大肠杆菌属菌类会受到 Colilert 特殊配方的基质选择性的抑制作用（专利技术）。 二、 仪器和试剂耗材 1、检测设备程控定量封口机 Quanti- Tray Sealer Model 2X 美国 IDEXX； 2、可充电紫外灯，6W，220V，366nm； 3、紫外线防护镜； 4、DST 酶底物法 24 小时 Colilert 试剂 美 程控定量封口机 国 IDEXX； 5、51 孔定量盘（无菌）；97 孔定量 盘（无菌） 6、阳性标准比色瓶，阳性 51 孔标准 比色盘； 7、100
3、mL 含硫代硫酸钠无菌取样袋/瓶； 2 MUG试 剂 （ 科 立得 ） 定 量 盘 （ 51孔 或 者 97孔 ） 取 样 瓶 8.记号笔； 9.无菌剪刀； 10.无菌夹子； 11.一次性医用无菌手套。 四、实验步骤 1.操作流程图 酶底物法即可以作定性又可以作定量分析，同时检测两个指标，总大肠菌 群（total coli）和大肠埃希氏菌（Escherichia coli），方法简便，快速， 结果准确。 2.操作说明 注意：如果不按照说明使用机器，可能会有人员伤害、机器损害、其他财 产损害以及出现检测结果不准确。 （1） 操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。 （2） 打开电源开关，橙黄
4、色指示灯应当亮起。 （3） 程控定量封口机需要预热直到绿色指示灯亮起（大约 10 分钟） 。只 有当两个灯都亮时，才说明机器达到工作温度。 3 （4） 大肠菌群、大肠埃希氏菌：取 100mL 水样加入酶底物试剂 1 支混匀， 转入 51 孔或 97 孔定量盘内（注意：在取水样和去定量盘时手不能触碰到含有 少量硫代硫酸钠的无菌取样瓶及定量盘封口处，以免影响检测结果），封口后 于 361培养 24h，观察结果。耐热大肠菌群：实验同上，但培养温度变为 44.50.5 （5） 把橡胶垫放到进口托盘架上，有大矩形孔的一头在外。 （6） 把装有样品和 DST Colilert 试剂的定量托盘放入橡胶垫中，
5、注意 定量托盘的每个凹陷要对准橡胶垫上对应的空。 （7） 向机器方向轻轻推动橡胶垫，直到机器抓住橡胶垫，并带动其进入 机器。 （8） 大约 15 秒钟，定量托盘封口完成，从机器后出来。请从机器后拿 出橡胶垫和定量托盘。 （9） 任何时候，如果需要使机器反转，从前面退出橡胶垫（例如当定量 托盘没放平就将橡胶垫放入机器） ，请按反转钮。但是，当橡胶垫已经完全进入 机器中，请不要按反转开关。如果有多个橡胶垫，可以连续放入机器。 检测结果说明： 现象 结果 比阳性比色对照品的黄色浅 总大肠菌群、大肠埃希氏菌为阴性 与阳性比色对照品的黄色相近 或更深 总大肠菌群为阳性 与阳性比色对照品的黄色相近 或更深
6、，且在紫外灯下显荧光 总大肠菌群、大肠埃希氏菌为阳 性 （10） 在暗室中，使用 6 瓦，366nm 的紫外灯在距样品 15 厘米左右的位置 观测是否显荧光。 （11） 结果应在 24-28 小时内读取。此外，总大肠菌群和大肠埃希氏菌培 养时间小于 24 小时已经为阳性；或总大肠菌群和大肠埃希氏菌大于 28 小时依 然为阴性，则结果也有效。 注意： 1.检测试剂于 230避光储存； 2.a.使用过的取样统一收集进行灭菌处理； b.橡胶插垫可以放到高压消毒锅中进行消毒，也可以用异丙醇或家用漂 白剂清洗。清洗时应注意这些清洗剂的危害。要经常清洗橡胶插垫，确保橡胶 插垫上不要有污垢。 一般情况下可使
7、用柔软的干布清洗封口机外壳。也可以用异丙醇或家用漂 4 白剂清洗，但要注意个人防护。 只有专门指定的人员才可以打开封口机的前挡盖。请参照保养手册，清洗 封口机的内部。清洗工作一定要有经过培训的人员来完成。如果有样品从机器 中滴出，请不要打开前挡盖或使得封口机倾斜； 3.拿出定量盘后应尽快用无菌夹子夹住袋口，以免剩余定量盘被细菌感染； 4.使用后关掉机器； 5.技术参数 重量 规格 (cm) 周围温度 电源 16 公斤 30H x 27D x39W 0-32oC 220V,50Hz,3Amp 附表： 1.51 孔定量盘法不同阳性结果的 MPN 值表 2.97 孔定量盘法不同阳性结果的 MPN 值表
