细胞因子生物学活性检测.doc

1、细胞因子生物学活性检测 细胞因子水平测定是细胞免疫功能检测的一个重要组成部分。由于许多细胞因子 cDNA 克隆和表达的成功，给细胞因子单克隆抗体制备、生物学功能的鉴定提供必要条件。目前 检测细胞因子水平主要包括两类方法：一是生物学活性的检测，这类方法是利用细胞因子 某一特定的生物学作用所设计的检测方法，如 IL-2维持活化 T细胞的增殖，IFN 能保护病 毒对正常细胞的感染，TNF- 选择性杀某些肿瘤细胞等，因此敏感性也较高；二是定量的 检测，常用酶联免疫吸附试验(ELISA)，如多克隆抗体与单克隆抗体，识别不同表位两种单 克隆抗体的双抗体夹心法，生物学和定量的检测方法各有优缺点，在必要时可同

2、时进行检 测。 一、白细胞介素 1(IK-1)生物学活性测定 白细胞介素 1是一种重要的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞产生，IL-1 不仅对多种 免疫活性细胞有重要的调节功能，而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。 目前对 IL-1产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。 ConA 刺激小鼠胸腺细胞检测 IL-1 生物学活性 (一) 原理 小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达 IL-1受体，在有 IL-1同时存在的条件下，IL-1 可 协同丝裂原促 T细胞的增殖作用。根据加入 IL-1后增殖水平(H-TdR 掺入率)的增加可计 算出样品中 IL-1的活性单位，或计算出刺激指数。 (二)

3、 操作步骤 取 68 周龄 C57BL16小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺 置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液 调整细胞数为 1.510ml 细胞悬液内加入 ConA，使终浓度为 3gml，在 96孔 培养板中加 100l(1.510细胞) 加入不同稀释度待测样品和 IL-1标准品 100l孔(ConA 终浓度为 1.5gml) 37 CO孵箱 66h 每孔加H-TdR 0.5ci 37 CO 孵箱 6h 多头细胞收集仪收获于 9999型玻璃纤维纸上 烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测 计数 计算: 1. 从 IL-1标准曲线上测得 IL-1的活性单位 2. 也可用刺激指数(SI

4、)表示 实验组 cpm SI 100 对照组 cpm (三) 试剂和器材 1. 10 FCS RPMI1640，96 孔培养板，CO 孵箱 2. 标准 IL-1， ConA 3. H-TdR，PPO、POPOP，二甲苯 4. 9999 型玻璃纤维滤纸，细胞收集仪 5. 液闪计数仪 (四) 注意事项 1. 不同品系小鼠对 IL-1的反应性有差异，据国内资料报道以 C57BL为好。 2. 不同周龄小鼠胸腺细胞对 ConA反应性不一，一般选用 68 周龄，小于 5周或大 于 10周龄小鼠胸腺细胞对 ConA反应不稳定。 3. ConA 促丝裂原作用要进行预试，一般采用亚适剂量。 应用 EL-4 CT

5、LL 检测 IL-1 生物学活性 IL-1 是一种十分重要的免疫调节因子，同时也是一种可引起发热和导致多种病理损伤 的重要的内源性致热原和炎症介质。目前 IL-1 检测方法有多种，主要包括：小鼠胸腺细 胞法，黑素瘤细胞增殖抑制法，纤维母细胞法、T 淋巴细胞系法以及 EBV转化 B细胞法等。 原理：小鼠胸腺瘤细胞系 EL4的某些亚克隆细胞表面具有高密度 IL-1受体，在 IL-1诱导下产生高水平的 IL-2，通过用 IL-2依赖株 CTLL-2检测 IL-2的生物学活性，从 而反映检测样品中 IL-1的水平。 操作步骤： 1. 用 EL细胞两步法检测 IL-1活性： 收集处于对数生长期的 EL细

6、胞 洗涤后，用 1FCS RPMI1640 重悬细胞，并 调整细胞浓度 210/ml， 加处 96孔板中，100l/孔 加入不同稀释度的 IL-1 或 IL-1，100l/孔， 同时设 1FCS RPMI 1640 对照 5CO,37 培养 1824 小时 按终稀释度为 11020 转入另一块 96孔板中 用 CTLL-2 检测 IL-2活性、检测方法见“IL-2 检测“ 2. 用 EL4细胞一步法检测 IL-1活性 用 5FCS RPMI 1640 调整 EL4 细胞浓度至 210/ml，CTTL-2 浓度至 410/ml 加入 96孔板中，两种细胞各加 50l/孔 加入不同稀释度的 IL-

7、1或待测样品，同 时设 EL和 CTLL-2细胞对照 置 5CO,37培养 2428 小时后加入 H-TdR,0.5ci/50l/孔,继续培养 68 小时 收集样品， 计数 试剂和器材 1. EL细胞 2. CTLL-2 细胞 3. 标准 rIL-1。 4. H-TdR、POPOP、PPO、二甲苯。 5. 玻璃纤维滤纸，细胞收集仪。 6. 计数仪 7. 96 孔板，无菌吸管，滴管、试管及加样器头。 8. FCS,RPMI 1640,CO培养箱等。 注意事项： 1. 在一步法检测 IL-1时，其 EL细胞浓度不宜超过 110/孔，血清终浓度应 5。 2. 在二步法检测 IL-1时，其 EL细胞浓

8、度在 210/孔时，犉 d转移上清稀释度不 宜低于 18,其诱导时间应 1224 小时间为佳。诱导血清浓度应1。 3. 在检测经诱导的上清中 IL-1时，应避免使用 A23187，TPA 和 ConA等较强的能诱导 EL细胞产生 IL-2的诱导剂来刺激 IL-1的产生。 二、白细胞介素 2(IL-2)的生物学活性测定 (一) 原理 IL-2 主要由活化 T细胞产生，又为 T细胞增殖所必需，故称 T细胞生长因子（ T Cell Growth factor, TCGF ）。IL-2 产生的水平反映 T细胞的功能，牪;仅是免疫调节重 要的研究对象，而且与临床多种疾病密切相关，CTLL 是 C57BL

9、6 来源的。犘!鼠杀伤性 T 淋巴细胞细胞系，由 Gills 1977年建立，只有在 IL-2存在的培养基中才能生长。因此可 作为指示细胞来测定待检样品中 IL-2的水平。除 CTLL外，丝裂原活化的 T淋巴母细胞亦 可作为检测 IL-2活性的指示细胞。 (二) 方法 可根据实验室条件，选用H-TdR 掺入法和 MTT法 1. H-TdR 掺入法 IL-2 依赖的 CTLL用 10FCS RPMI1640 洗涤 2 次，每次 1000rpm, 5min, 除去原培养液中的 IL-2 调整活细胞数 110ml 96 孔平底培养板中每孔加 100l CTLL 悬液(110孔) 加入不同稀释度标准

10、IL-2和待测样品 37CO 孵箱，培养 1824h 每孔加H-TdR 0.5ci50l 4-6h 用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上 干燥后，移入液闪瓶中，加入 1ml闪烁液， 于液闪仪中测 射线的 cpm值 计算(举例) 将标准 IL-2不同浓度和待测样品不同稀释度时所获得的 cpm值作图，犠轴采用概率 座标(probit)，横座标为 Log2稀释倍数。从 50的最高 cpm值画一横线，犛 k标准和待 检斜线的交点，即可计算出待检样品 IL-2的活性单位。 如标准品 50最大 cpm值时为 1uml，则待测标本 14 时为 1uml,原液则为 4/ml 2. MTT 法 MTT(3-(4,5-

11、dimcthylthioazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide , 四甲 基偶氮唑盐)可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱 氢酶可将淡黄色的 MTT还原成紫兰色的甲 (Formazan)，将结晶的甲 溶解释放，可根据 所测的 OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待检样品中 IL-2的水平。在掌握良好的 实验条件下，MTT 法的敏感性可接近H-TdR 同位素掺入法。 IL-2 依赖的 CTLL用 10FCS RPMI1640 洗涤 2次， 每次 1000rpm, 5min, 除去原培养液中的 IL-2 调整活细胞数

12、 1210ml 96 孔平底培养板中每孔加 100l CTLL 悬液(1210孔) 加入不同稀释度标准 IL-2和待检样品，100l孔， 每份设 3个重复孔 CO 孵箱培养 1824h 每孔加 10l MTT(5mgml 溶于 PBS) 4h，37 轻轻吸出 150l 上清，加入 150l 二甲亚砜(DMSO) 或酸性异丙醇(异丙醇溶于 0.04N HCl) 溶解 10min，测 OD值(570nM) (三) 试剂和器材 1. IL-2 依赖的 CTLL 2. 10FCS RPMI1640 3. H-TdR 4. 标准 IL-2 5. MTT, 酸性异丙醇，二甲亚砜(DMSO) 6. PPO，

13、POPOP，二甲苯 7. 9999 型玻璃纤维滤纸 8. 96 孔平底培养板 9. 细胞收集仪 10. CO 孵箱 11. 液闪计数仪 (四)注意事项 1. CTLL 细胞洗涤要充分，但操作必须轻柔，离心速度不宜过高，否则影响细胞的增 殖。 2. 避免同位素污染。 3. 加标准 IL-2或待测样品时，按从低浓度到高浓度顺序加。 4. 加入H-TdR 最适时机是阴性对照细胞开始全部死亡。 5. CTLL 细胞冻存后复苏较困难，用含有丝分裂原条件培养基长期培养容易发生变异。 三、白细胞介素 6(IL-6)生物学活性检测 白细胞介素 6(IL-6)是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子。HTLV-1

14、感染的 T 淋巴 母细胞系、单核细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞以及某些肿瘤细胞均可产生 IL-6。某些 急性炎症、自身免疫性疾病、淋巴细胞恶性肿瘤(如多发性骨髓瘤) 等与病人体内 IL-6 水平 异常增高有关。 原理：IL-6 在体外能促进 B 细胞杂交瘤的生长，故又称为杂交瘤生长因子(HGF)。 小鼠 B 细胞杂交瘤 7TD1 是一株对 IL-6 依赖的细胞系，由 Van Snick 1986 年建立，只有在 IL-6 存在的培养基中才能生长，可以作为指示细胞来测定待检样品中 IL-6 水平。这类 IL-6 依赖的小鼠 B 细胞杂交瘤细胞系还有 MH60BSF2、B9 等。 方法：主要为H-

15、TdR 掺入法 IL-6 依赖的 7TD1 细胞用无 FCS 的 RPMI1640 洗涤 2 次 每次 1000rpm，5min，除去原培养液中的 IL-6 用 10FCS-RPMI1640 调整活细胞数 210/ml 96 孔平底培养板中每孔加 100l 7TD1 悬液(210/ 孔) 加入不同稀释度标准 IL-6 和待检样品(100l/孔) 37，5CO孵箱培养 4872h 每孔加H-TdR 0.5Ci/50l 10h 用多头细胞收集仪收获于玻璃纤维滤纸上 干燥后移入液闪瓶中，加入 1ml 闪烁液，于液闪仪中测 射线的 cpm 值。 计算： 1. 根据 cpm 值，将能使 7TD1 细胞H

16、-TdR 掺入 cpm 值达到最大值 50的 IL-6 的活 性定为 1u/ml。 2. 以刺激指数(SI)表示。 试剂和器材 1. IL-6 依赖的 7TD1 细胞系 2. 10FCS-RPMI1640 及无 FCS 的 RPMI1640 3. H-TdR 4. 标准 IL-6 5. PPO,POPOP,二甲苯。 6. 9999 型玻璃纤维滤纸。 7. 96 孔平底培养板 8. 多头细胞收集仪 9. CO孵箱 10. 液闪计数仪 注意事项： 1. 7TD1 细胞洗涤要充分、轻柔，每次弃洗涤上清力求彻底。 2. 避免同位素污染。 3. 加样品时，应从低浓度到高浓度顺序加。 4. 加入H-TdR

17、 最适时机是阴性对照 95以上死亡。 5. 为了增加检测方法的敏感性，可采用新复苏 7TD1 细胞，或用 pH4.0 枸椽酸缓冲液 处理培养状态的 7TD1 细胞。 四、干扰素(IFN)生物学活性 检测 干扰素(IFN)根据其产生细胞不同和理化性质、犐 z物学特性的差异可分为 干扰素 (IFN-)、 干扰素(IFN-)和 -干扰素(IFN-)。它们在机体免疫调节、抗病毒感染 中具有重要作用。检测 IFN的方法主要分为定量测定(常用 ELISA)和生物学活性的检测， 后者较为常用。 (一)原理 干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞 Wish株、人喉癌细胞株 Hep-2以及人 胚肌皮或肺单层

18、细胞)产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根 据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。 (二) 操作步骤 96 孔培养板中加入不同稀释度的 IFN和标准 IFN， 每个稀释度设 3孔，每孔 50l，病毒对照不加 IFN 每孔加入 100l 1.5210 ml Wish 或 Hep-2细胞悬液，37、CO 孵箱培养 612h， 使细胞贴壁为单层 每孔加入 50l 含 100个 TCID50 VSV, 细胞对照不加病毒液 根据细胞病变状态，终止培养前 34h 加入 5mgml MTT, 15L孔 加入适量生理盐水，用滴管轻轻吹吸 弃去悬浮病变细胞和死细

19、胞 200l孔 二甲亚砜(DMSO)，作用 10min 测 OD(570nm),表示活细胞中含甲 的量， 也可用刚果红摄入法、结晶紫染色法 测定 IFN对活细胞的保护水平 计算: 以保护半数(50)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为 1个干扰素活性单位。也 可从标准曲线中求得待测样品的 IFN活性单位。 (三) 试剂和器材 1. VSV 2. WISH、HeP-2 细胞株或人胚肌皮或肺单层培养物。 3. MTT3-(4,5 二甲噻唑-2-yl)-2,5-2 苯基-四唑溴盐，二甲亚砜(DMSO)，刚果红， 结晶紫等。 4. 10FCS RPMI1640, 培养板、培养瓶、CO 孵箱、超净台、酶

20、联检测仪。 (四) 注意事项 1. 实验时先加 IFN，后加指示细胞，以使细胞均匀分布于培养板底部。 2. 本法对天然培养上清或重组 IFN-、IFN- 和 IFN- 均可检测其活性单位。 五、肿瘤坏死因子-(TNF-) 生物学活性测定 肿瘤坏死因子-(TNF-)是一种主要由单核- 吞噬细胞产生的单核因子，不仅具有选择 性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节作用。其检测方法主要包括生物学活性测定 和免疫学检测方法。其中细胞毒生物学检测方法敏感性较高，最为常用；免疫学检测方法 包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫测定法。 (一) 原理: TNF- 受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞，

21、根据 TNF-与相应靶细胞结合后引 起不同的生物学效应，建立了多种检测 TNF-生物学活性方法。某些肿瘤细胞膜表面的 TNF-受体与 TNF-结合后，可导致这些肿瘤细胞的死亡，可通过检测对肿瘤细胞的杀伤 能力，来反映 TNF-的生物学活性。若这种肿瘤细胞先用 3H-TdR 标记，则被杀伤后H- TdR 释放至细胞外，牽 I 通过测定肿瘤细胞释放H-TdR 的量来反映 TNF-的杀伤活性。 (二) 操作步骤: 0.25胰蛋白酶消化处于对数生长期的 L929 细胞 用 RPMI1640 洗涤细胞后，调整细胞浓度至 210ml 加入H-TdR，20ciml 置 37，5CO 培养箱中 23h，摇动

22、1 次30min 用 RPMI1640 洗涤 2 次，800rpm5min次 调整细胞浓度至 2310ml 后，加入 96 孔 培养板中，100l孔 加入不同稀释度的待测样本(设三个重复孔) 加入放线菌素 D，使放线菌素 D 最终浓度至 1gml 用时设放线菌素、完全培基阴性对照和 rTNF-标准 品阳性对照 37, 5CO 培养中 24h 加入 3胰蛋白酶和 0.25DNA 酶各 10l孔 37，30min 用 DYQ-型多头细胞收集器收集样品于 “9999“型玻璃纤维滤纸上 烤干后，进行 计数 结果判定: 1. TNF- 作用 24h 后，在倒置显微镜下判定 50L929 细胞杀伤的稀释度

23、即为个 TNF-活性单位。 2. 根据测得的 cpm 值按下列公式计数活性单位: TNF- 活性单位(Uml) 放线菌素 D 对照组 cpm-实验组 cpm 标准品活性单位 待测样品稀释倍数 放线菌素 D 对照组 cpm-标准品 cpm (三) 试剂和器材: 1. 鼠成纤维细胞(L929) 2. rTNF- 和待测样品 3. 放线菌素、DNA 酶、胰蛋白酶 4. 10FCS RPMI1640，RPMI1640 5. H-TdR，PPO，POPOP、二甲苯，玻璃纤维滤纸 6. 96 孔培养板、无菌吸管、滴管、试管、加样器和加样器头 7. CO 培养箱、倒置显微镜、超净台等 (四) 注意事项: 1

24、. 用于标记H-TdR 的 L929 细胞要处于对数生长期，否则H-TdR 掺入率低，影响 实验结果。 2. 标记后的 L929 细胞应充分洗涤，以洗掉游离的H-TdR，牱 q 则会影响完全培基 对照组 cpm 值。 3. 胰蛋白酶和 DNA 酶浓度和消化时间要严格控制，犆?批酶均要摸索最适浓度和时 间。否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。 4. 为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素 D，但浓度不宜过大， 一般最终浓度为 0.51gml。 5. 在测定 PHA 等丝裂原诱导的 PBMC 培养上清时，要注意排除 TNF-(淋巴毒素)的 影响。因为 TNF-细胞毒生物学作用等很多生物学效应均与 TNF-相似。