菌液稀释级数确认方案.doc

1、编号：888888 第 0 页 共 9 页 菌液稀释级数确认方案 888888888 有限公司 8888 年 88 月 编号：888888 第 1 页 共 9 页 目 录 1 目的 2 适用范围 3 依据 4 验证时间 5 验证小组成员及职责 6 验证所需要仪器设备、培养基、菌种及关键操作文件 7 接受标准 8 测试方法 9 测试结果 10 异常情况及处理 11 结论 12 再验证周期 编号：888888 第 2 页 共 9 页 1 目的 建立菌液稀释级数确认方案，确定含菌量为 50100cfu/ml 或 10100cfu/ml 时， 各试验菌应当稀释的倍数或级数。 2 适用范围 2.1 本确

2、认方案适用于验证试验或日常工作中涉及的菌种稀释操作。 2.2 确认对象为： 50100cfu/ml：大肠埃希菌 MCC(B)44102、金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003、枯草芽 孢杆菌 CMCC(B)63501、白色念珠菌霉 CMCC(F)98001。 10100cfu/ml：乙型副伤寒沙门菌 CMCC(B)50094。 3 依据 药品 GMP现行版、 药品 GMP 指南国家药监局认证中心编写 2011 年版 中国药典现行版。 中国药品检验标准操作规程现行版。 4 验证时间 验证方案于 2014 年 月 日批准后，整个验证活动应在 10 个工作日内完成。 5 验证小组成员及职责 小组职

3、务 岗位 姓名 责任 组长 化验室主任主任 编制验证方案，编制验证报告；进 行验证过程及结论的评价与分析； 组织协调实施本验证工作。 QA 主管 对编制的方案进行审核 质量部部长 批准再验证方案；评价与分析确认结果；对验证报告进行最终结论。 QA 监督和复核方案实施过程。 组员 微检 QC 负责方案的执行。 6 验证所需要的仪器设备、培养基、菌种及关键操作文件 6.1 验证需用仪器设备 器具名称 规格型号 检定日期 检定单位 有效期 细菌培养箱 霉菌培养箱 高压蒸汽灭菌器 架盘天平 水浴锅 编号：888888 第 3 页 共 9 页 净化工作台（阳 性） 6.2 试验培养基 名称 生产厂家 批

4、号 有效期 营养琼脂培养基 营养肉汤培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 改良马丁培养基 改良马丁琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 6.3 试验菌种 菌珠名称 来源 购入日期 传代次数 大肠埃希菌 MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌 CMCC(B) 63501 白色念珠菌霉 CMCC(F) 98001 乙型副伤寒沙门菌 CMCC(B)50094 6.4 验证所需要关键文件及存放地方 编号：888888 第 4 页 共 9 页 关键资料名称 存放地点 细菌培养箱使用和清洁操作规程 霉菌培养箱使用和清洁操作规程 高压蒸汽灭菌器使用和清洁操作规程 舒筋活血丸质量标准及

5、检验方法 微生物限度检查法操作规程 7 接受标准 7.1 阴性对照组测试结果应为阴性。 7.2 各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 7.3 各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级 的菌落数应呈约 10 倍关系。 8 测试方法 按药典方法制备菌液，取 1ml 菌液在若干支含 9ml 的 0.9%无菌氯化钠溶液中，逐级 稀释成 100、10 -1、10 -2、10 -8级数的菌悬液。分别取各级 1ml，注入平皿，倾倒在琼 脂培养，按平皿计数法培养，测定各级菌落数。该试验独立平行进行 3 次。 8.1 菌液制备 8.1.1 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希

6、菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养 物分别接种至 3 支 10ml 营养肉汤培养基中，经 32.52.5培养 1824h，备用。 8.1.2 取色念珠菌的新鲜培养物至 10ml 改良马丁培养基中，经 25.52.5培养 2448h，备用。 8.2 无菌氯化钠溶液的制备 至少准备 9ml/支9 支 0.9%的无菌氯化钠溶液。 8.3 稀释 8.3.1 分别取 1ml 菌液（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙 门菌、白色念珠菌）在 1 支含 9ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，用吸管吹打约 10 下，即成 10-1级，吸取该管菌液 1ml 至下支含 9ml0.9%的无菌

7、氯化钠溶液中，用刻度管吹打约 10 下，即成 10-2级，依次，逐级稀释直至 10-8级数，每递增一个稀释级，必须换一个吸管。 8.4 注皿 分别吸取上述各菌各级菌悬液 1ml 于平皿中，平行制备 2 个皿，金黄色葡萄球菌、 大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌倾倒约 15ml 的营养琼脂培养基，白色念 珠菌倾倒玫瑰红钠琼脂培养基。按微生物限度检查法操作规程中的平皿法，培养， 测定各皿各菌菌落数。 9 测试结果：见附表 1、2、3。 10 异常情况及处理： 编号：888888 第 5 页 共 9 页 质量负责人： 验证小组组长： QA： 11 结论 11.1 按照本确认方案，确定了各菌达

8、到规定含菌量时的稀释级别。 菌珠名称 含菌量 确定的稀释级别 大肠埃希菌 MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌 CMCC(B) 63501 白色念珠菌霉 CMCC(F) 98001 50100cfu/ml 乙型副伤寒沙门菌 CMCC(B)50094 10100cfu/ml 质量负责人： 验证小组组长： QA： 12 再验证周期 12.1 当操作人员或接种方法发生变化时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。 12.2 国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。 12.3 定期验证暂定为二年。 编号：888888 第 6 页 共 9 页

9、 附表 1 菌液稀释级别确认记录（单位：cfu） 第 1 次试验 试验日期： 报告日期： 营养琼脂培养基 玫瑰红钠 培养基 培养皿性质 金黄色葡萄球 菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 乙型副伤寒沙 门菌 白色念珠菌 培养温度 培养时间 级数 皿号 1 2 平 均 1 2 平 均 1 2 平 均 1 2 平 均 1 2 平 均 10-0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 接受标准 50100cfu/ml 10100cfu/ml 50100cfu/ml 符合要求的级 数 分析：1、阴性对照组，即 10-0级，测试结果应为阴性。 结果：符合要求 不符合要求

10、2、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：符合要求 不符合要求 3、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀 释级的菌落数应呈约 10 倍关系。 结果：符合要求 不符合要求 检验人： 复核人： 质量部 QA: 编号：888888 第 7 页 共 9 页 附表 2 菌液稀释级别确认记录（单位：cfu） 第 2 次试验 试验日期： 报告日期： 营养琼脂培养基 玫瑰红钠 培养基 培养皿性质 金黄色葡萄球 菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 乙型副伤寒沙 门菌 白色念珠菌 培养温度 培养时间 级数 皿号 1 2 平 均 1 2 平 均 1 2 平 均 1 2

11、平 均 1 2 平 均 10-0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 接受标准 50100cfu/ml 10100cfu/ml 50100cfu/ml 符合要求的级 数 分析：1、阴性对照组，即 10-0级，测试结果应为阴性。 结果：符合要求 不符合要求 2、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：符合要求 不符合要求 3、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀 释级的菌落数应呈约 10 倍关系。 结果：符合要求 不符合要求 检验人： 复核人： 质量部 QA: 编号：888888 第 8 页 共 9 页

12、 附表 3 菌液稀释级别确认记录（单位：cfu） 第 3 次试验 试验日期： 报告日期： 营养琼脂培养基 玫瑰红钠 培养基 培养皿性质 金黄色葡萄球 菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 乙型副伤寒沙 门菌 白色念珠菌 培养温度 培养时间 级数 皿号 1 2 平 均 1 2 平 均 1 2 平 均 1 2 平 均 1 2 平 均 10-0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 接受标准 50100cfu/ml 10100cfu/ml 50100cfu/ml 符合要求的级 数 分析：1、阴性对照组，即 10-0级，测试结果应为阴性。 结果：符合要求 不符合要求 2、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：符合要求 不符合要求 3、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀 释级的菌落数应呈约 10 倍关系。 结果：符合要求 不符合要求 检验人： 复核人： 质量部 QA: