蛋白质测定方法.docx

1、蛋白质的定量测定微量凯氏定氮法(micro Kjeldahl method) 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为 16，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测 定，通常采用微量凯氏定氮法。 凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可 测定各种不同形态样 品等两大优点，因而被公 认为是 测定食品、饲料、种子、生物制品、 药品中蛋白质含量的标 准分析方法. 实验原理 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为 16， 测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏 定氮法由于具有测定准确度高，可测定

2、各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测 定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下： 1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮硫酸铵。为加快反应，添 加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需 30min 至 1h，视样品的性质而定。 2. 加碱蒸馏：硫酸铵与 NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成 NH3, 通过蒸馏导入过量 酸中和生成 NH4Cl 而被吸收。 3. 滴定：用过量标准 HCl 吸收 NH3，剩余的酸可用标准 NaOH 滴定，由所用 HCl 摩尔数 减去滴定耗去的 NaOH 摩尔数，即为

3、被吸收的 NH3 摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红 卫指示剂。HClNaOHNaCl +H2O 本法适用于 0.2 2.0 mg 的氮量测定。 1.热源 2. 烧瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管 5玻璃杯 6. 棒状玻塞 7. 反应室 8. 反应室外壳 9. 夹子 10. 反应室中插管 11. 冷凝管 12. 锥形瓶 13. 石棉网 微量凯氏蒸馏装置示意图 试剂和器材 一、试剂 浓硫酸；30过氧化氢溶液；10 M 氢氧化钠；0.01M 的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg 氮 /mL） 催化剂：硫酸铜：硫酸钾1：4 混合，研细。 指示剂：0.1甲基红乙醇溶液。 二、测试样品 牛血清白蛋白。 三、器

4、材 微量凯氏定氮仪；移液管 1mL（3 ）；2mL（1）；微量 滴定管 5mL（1）; 烧杯 200mL（2 ）；量筒 10mL（1）；三角烧瓶 150mL（4）；凯氏烧瓶 50mL（4），吸 耳球（1）；电炉；分析天平。 操作方法 一、样品处理 称取牛血清白蛋白 50mg，加入 2 个凯氏烧瓶中，另 2 个凯氏烧瓶为空白对照，不加样品。 分别在每个凯氏烧瓶中加入约 500mg 硫酸钾硫酸铜混合物，再加 5 mL 浓硫酸。 二、消化 将以上 4 个凯氏烧瓶置于通风橱中电炉上加热。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲 到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出 SO2 白烟后，适当加强火力，继续

5、消化,使 瓶内液体微微沸腾，大约维持 2 3h。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧 瓶取下，稍冷，将 30过氧化氢溶液 1 2 滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到 消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入 50mL 容 量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。 三、蒸馏 1. 蒸馏器的洗涤 蒸气发生器中盛有加有数滴 H2SO4 的蒸馏水和数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、 反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤 10 分钟左右（此时可 用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有 5mL 2硼酸液和 1 2 滴

6、指示剂的锥形瓶置于冷凝 管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏 1 2 分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已 洗净。 2. 消化样品及空白的蒸馏 取 50mL 锥形瓶数个，各加 25mL 0.01M 标准 HCl 和 1 2 滴指示剂，用表面皿覆盖备用。 取 2mL 稀释消化液，由小漏斗加入反应室。将一个装有 0.01M 标准 HCl 和指示剂的锥形 瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。 用小量筒量取 5mL 10M NaOH 溶液，倒入小漏斗，让 NaOH 溶液缓慢流入反应室。尚未完 全尽时，加紧夹子，向小漏斗加入约 5mL 蒸馏水，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏 斗内作水封。

7、加热水蒸气发生器，沸腾后，关闭收集器活塞。使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反应 生成的 NH3 逸出被吸收。待氨已蒸馏完全，移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约 1cm，并用 少量蒸馏水冷凝管口。取下锥形瓶，以 0.01M NaOH 标准溶液滴定。记下所耗去的体积。 3. 蒸馏后蒸馏器的洗涤 蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然 下降，即可将反应室残液吸至收集器。 标准样品的测定 在蒸馏样品及空白前，为了练习蒸馏和滴定操作，可用标准硫酸铵试做实验 2 3 次。 标准硫酸铵的含氮量是 0.3mg/mL，每次实验取 2.0mL。 四、计算 样品的含氮量（mg/mL）= 若测

8、定的蛋白质含氮部分只是蛋白质（如血清），则： 样品中蛋白质含量（mg/mL） 式中：A 为滴定空白用去的 NaOH 平均 mL 数，B 为滴定样品用去的 NaOH 平均 mL 数， V 为样品的 mL 数，0.01 NaOH 的摩尔浓度，14 为氮的原子量，6.25 为系数（蛋白质的平 均含氮量为 16，由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数 6.25 即为蛋白质量），N 为样品 的稀释倍数。 注意事项 （1）必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。 （2）凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。 （3）小心加样，切勿使样品沾污口部、颈部。 （4）消化时，须斜放凯氏烧瓶（45o 左右）。火力

9、先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、 瓶颈壁上。 （5）蒸馏时，小心加入消化液。加样时最好将火力拧小或撤去。蒸馏时，切记火力不稳， 否则将发生倒吸现象。 （6）蒸馏后应及时清洗定氮仪。 植物体内可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法) 考马斯亮蓝 G-250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G-250 在游离 态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区 结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在 595nm。在一定蛋白质浓度范 围内（0100g/ml ），蛋白质色素结合物在 595nm 波长下的 光吸收与蛋白质含量成正比。 植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量

10、是了解植物体总代谢的 一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位mg 蛋白）表示酶活力 大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用 测定方法有 Lowry 法和考马斯亮蓝 G-250 染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。 【原理】 考马斯亮蓝 G-250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G-250 在游离态下 呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在 595nm。在一定蛋白质浓度范围内（ 0100g/ml），蛋白质色素结合物在 595nm 波长下 的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于

11、蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下 1h 内保持稳 定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。 【仪器与用具】 分光光度计，10ml 量筒 1 支；研体；10ml 容量瓶 1 支；1ml 刻度吸管 3 支；10ml 具塞刻 度试管 14 支。 【试剂】 （1）牛血清白蛋白 配成 1000g/ml 和 100g/ml； （2）考马斯亮蓝 G-250：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50ml 90%乙醇中，加入 85%（W/V ）磷酸 100ml，最后用蒸馏水定

12、容至 1000ml。此溶液在常温下可放置一个月； （3）90%乙醇；（4）磷酸（ 85%，W/V）。 【方法】 1.标准曲线的绘制 （1）0100g/ml 标准曲线的制作取 6 支试管，按表 28-1 数据配制 0100g/ml 血清白蛋 白液各 1ml。准确吸取所配各管溶液 0.1ml，分别放入 10ml 具塞试管中，加入 5ml 考马斯 亮蓝 G-250 试剂，盖塞，反转混合数次，放置 2min 后，在 595nm 下比色，绘制标准曲线。 表 28-1 配制 0100g/ml 血清白蛋白液 管号 1 2 3 4 5 6 100g/ml 牛血清蛋白量(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(m

13、g) 0 1.0 0 0.2 0.8 0.02 0.4 0.6 0.04 0.6 0.4 0.06 0.8 0.2 0.08 1.0 0 0.10 （2）01000g/ml 标准曲线的制作另取 6 支试管，按表 28-2 数据配制 01000g/ml 牛血 清白蛋白溶液各 1ml。与步骤（1）操作相同，绘出 01000g/ml 的标准曲线。 表 28-2 配制 01000g/ml 血清蛋白血液 管号 7 8 9 10 11 12 1000g/ml 牛血清白蛋白（ml） 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) 0 1.0 0 0.2 0.8 0.2 0.4 0.6 0.4 0.6 0.4 0.6

14、0.8 0.2 0.8 1.0 0 1.0 2. 样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液 0.1ml（样品提取见各酶活测定），放 入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入 5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，充分混合，放置 2min 后在 595nm 下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。 3. 结果计算 样品蛋白质含量（mg/g 鲜重）= 式中 C查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg ）； V提取液总体积（ml）； a测定所取提取液体积（ml）； W取样量（g）。 蛋 白 质 含 量 的 测 定 考 马 斯 亮 蓝 （ Coomassie Brilliant Blue） 染 色

15、 法 考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的 原理，定量的测定微量蛋白浓 度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种 方法的突出优点，因而正在得到广泛的 应用。 这一方法是目前灵敏度最高的蛋白 质测定法。 实验原理 考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原 理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种 方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液

16、中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位 置，由 465nm 变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定 595nm 处光吸收 的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特 别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 考马斯亮蓝染色法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1mg。这是因为 蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而 光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5

17、分钟左右。由于 染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定， 且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和严 格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+ 、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘 油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于 不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定

18、，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷 基硫酸钠（SDS）等。 试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝 G250 100mg 溶于 50mL 95%乙醇中，加入 100mL 85%磷 酸，用蒸馏水稀释至 1000mL。 二、标准和待测蛋白质溶液 1标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯 度用 0.15mol/L NaCl 配制成 1mg/mL 蛋白溶液。 2待测蛋白质溶液：人血清，使用前用 0.15mol/L NaCl 稀释 200 倍。 三、器材 试管 1.515cm（6），试管 架，移液管管 0.5mL（2）；1mL（

19、2）；5mL（1）；恒温 水浴；分光光度计。 操作方法 一、制作标准曲线 取 7 支试管，按下表平行操作。 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液 （mL ） 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.15mol/LNaCl（mL ） 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 考 马 斯 亮 蓝 试 剂 （ mL） 5mL 摇匀，1h 内以 0 号管为空白对照，在 595nm 处比色: A595nm 绘制标准曲线：以 A595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 二、未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，

20、取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测 定的 A595nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白 质浓度（mg/mL）。 注意事项 在试剂加入后的 520min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比 色杯洗干净。 蛋白质的定量测定紫外（UV）吸收测定法 蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质在 280nm 波长 处有最大吸收值。在一定浓度范 围内，蛋白 质溶液的光吸收 值（A280 ）与其含量成正比关系， 可用作定量测定。紫外线

21、吸收法 测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度 盐类不干扰测定。因此，广泛 应用在柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。 实验原理 蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质在 280nm 波长处有 最大吸收值。在一定浓度范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系， 可用作定量测定。紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓 度盐类不干扰测定。因此，广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。此法的缺点 是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的 误差；（2）若样品中核酸等吸收紫外线的物质，

22、会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸 的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但是可作为初步 定量的依据。该法可测定蛋白范围应在 0.11.0mg /mL。 试剂和器材 一、标准和待测蛋白质溶液 1.标准蛋白溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成 1mg/mL 蛋 白溶液。 2. 待测蛋白质溶液：人血清，使用前稀释 100 倍。 二、器材 试管 1.515cm（9），试管 架，移液管 1mL（3）；2mL（2）；5mL（2）；分光光度 计。 操作方法 一、制作标准曲线 取 8 支试管编号，按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光

23、程为 1cm 的石英比 色杯，在 280nm 波长处分别测定各管溶液的 A280 值。以 A280 值为纵坐标，蛋白质浓度 为横坐标，绘制标准曲线。 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白质溶液（mL） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 蒸馏水（mL） 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 蛋白质浓度 (mg/mL) 0 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 1.00 A280 二、样品测定 取待测蛋白质溶液 1mL，加入蒸馏水 3mL，摇匀，按上述方法在 280nm 波长处测定光吸 收值，并从标准曲线上查出待

24、测蛋白质的浓度。 注意事项 由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。 因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。此外蛋白溶液 中存在核酸或核苷酸时也会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性。 蛋白质的定量测定福林酚法(Folin酚试剂法) Folin酚试剂法最早是由 Lowry 确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学 领域得到广泛的应用。此法的 显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin酚试剂 ，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。Folin酚试剂由甲试剂和 乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠 ，氢氧

25、化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。 实验原理 Folin酚试剂法最早是由 Lowry 确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学 领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂， 即 Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这个方法的优点是灵 敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是 严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团，如 CO-NH2,- CH2-NH2, CS-NH2 以及 Tris 缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰 Folin酚反应， 而且对后者的影响还要大得

26、多。此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。 Folin酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠 组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨 酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和 色氨酸的含量。本法可测定范围是 25250g 蛋白质。 试剂和器材 一、试剂 Folin酚试剂 : 试剂甲：4%碳酸钠溶液；0.2mol/L 氢氧化钠溶液；1% 硫酸铜溶液；2%酒石酸钾钠溶液。 临用前将（1）与（2）等体积配制

27、碳酸钠氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫 酸铜酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按 50:1 的比例配合，即成 Folin酚试剂甲。此 试剂临用前配制，一天内有效。 试剂乙： 称钨酸钠（Na2WO2?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g 置 2000mL 磨口回流装 置内，加蒸馏水 700mL，85%磷酸 50mL 和浓硫酸 100mL。充分混匀，使其溶解。小火加 热，回流 10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g， 蒸馏水 50mL 及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸 15min，以除去多余的溴。冷却后定容至 1000mL，过滤

28、即成 Folin酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中， 可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟， 恢复原色仍可继续使用。 试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L 左右），以酚 酞为指示剂，当溶液颜色由红紫红紫灰墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为 2mol/L 左右，将之稀释至相当于 1mol/L 酸度应用。 二、标准和待测蛋白质溶液 1. 标准蛋白质溶液 结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成 150g/mL 蛋白溶液 2. 待测蛋白质溶液 人血清，使用前稀释 1

29、50 倍。 三、器材 试管 1.515cm（6），试管 架，移液管 0.5mL（2）；1mL（2）；5mL（1）；恒温水 浴；分光光度计。 操作方法 一、制作标准曲线 取 7 支试管，按下表平行操作： 试管编号 试剂处理 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质溶液（mL） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（mL） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Folin-酚甲试剂（mL） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 摇匀，于 2025放置 10min Folin-酚乙试剂（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

30、 迅速摇匀，30（或室温 2025）水浴保温 30min，以蒸馏水为空白， 在 640nm 处比色 A640 绘制标准曲线：以 A640 值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 二、未知样品蛋白质浓度测定 取 2 支试管，按下表平行操作： 试管编号 试剂处理 空白管 2 样品管 2 血清稀释液 (mL) 0 0.2 蒸馏水 (mL) 1.0 0.8 Folin酚甲试剂 (mL) 5.0 5.0 摇匀，于 2025放置 10min Folin酚乙试剂 (mL) 0.5 0.5 迅速摇匀，30（或室温 2025）水浴保温 30min，以蒸馏水为空白，在 640nm 处比色 A6

31、40 三、计算 注意事项 (1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而 Folin酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用 生成碱性的铜蛋白质溶液。当 Folin酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管）， 使还原反应产生在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前。 (2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情 稀释。 蛋白质含量的定量测定 双缩脲法（ Biuret 法） 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结 合形成复杂的紫好色复合物。而蛋白 质及多肽的肽键与双 缩脲的结构类似，也能与 Cu2+形 成紫红色络合物，其最大光吸收在 5

32、40nm 处。其 颜色深浅与蛋白 质浓度成正比，而与蛋白质 的分子量及氨基酸的组成无关， 该法测定蛋白质的浓度范 围适于 110mg /mL。双 缩脲法常 用于蛋白质的快速测定。 实验原理 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形 成复杂的紫好色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与 Cu2+形成紫 红色络合物，其最大光吸收在 540nm 处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的 分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于 110mg /mL。双缩脲法常用 于蛋白质的快速测定。 紫红色铜双缩脲复合物分子结构为： 试剂和器材

33、 一、试剂 双缩脲试剂： 取 1.5g 硫酸铜（CuSO4?5H2O）和 6.0g 的酒石酸钾钠（NaKC4H4O6 4H2O）溶于 500mL 蒸馏水中，在搅拌下加入 300mL 10%NaOH 溶液，用水稀释至 1000mL。此试剂可长期保 存、备用。 二、标准和待测蛋白质溶液 标准蛋白溶液： 10mg/mL 结晶牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用 0.05mol/L 氢氧化钠溶液配 制） 。作为标准用的蛋白质要预先用微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配 制成标准溶液。 待测蛋白质溶液： 人血清（稀释 10 倍） 。测试其他蛋白质样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测

34、试范 围内。 三、器材 试管 1.515cm（16 ），试管 架，移液管 1mL（3）；5mL（1）；恒温水浴；分光光度 计。 操作方法 一、制作标准曲线 取 12 支试管分成两组，按下表平行操作： 0 1 2 3 4 5 标准蛋白液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白浓度(mg/mL) 0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 蒸馏水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 双缩脲试剂(mL) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 充分混匀后，室温下（2025）放置 30min A540 取两组测定的 A540 值的平均值，即 A540 为

35、纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 二、样品测定 取 4 支试管分成两组，按下表平行操作： 0 1 血清稀释液 (mL) 0 0.5 蒸馏水 (mL) 1.0 0.5 双缩脲试剂 (mL) 4.0 4.0 充分混匀后，室温下（2025）放置 30min A540 三、计算 取两组测定的平均值计算： 血清样品蛋白质含量（mg/100mL）= 其中,Y 为标准曲线查得蛋白质得浓度（ mg/mL），N 为稀释倍数，V 为血清样品所取的体 积（mL），c 为样品原浓度（mg/mL）。 注意事项 （1）须于显色后 30min 内比色测定。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。 （3）有大量脂肪性物

36、质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使 溶液澄清后离心，取上清液再测定。 紫外吸收法测蛋白质含量 1.280nm 的光吸收法 2.280nm 和 260nm 的吸收差法 3.215nm 与 225nm 的吸收差法 4. 肽键测定法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收 紫外光的性质。吸收高峰在 280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此 外，蛋白质溶液在 238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的 光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不

37、消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生 化制备中常用的（NH4）2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的 快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含 量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该 法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等 吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方 法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然

38、经过校 正，测定的结果还是存在一定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因 pH 的改变而有变化，因此要注 意溶液的 pH 值，测定样品时的 pH 要与测定标准曲线的 pH 相一致。 1. 280nm 的光吸收法 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm 处具有最大吸收，且各种蛋白质的 这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在 280nm 处的吸光度值是最常用的紫 外吸收法。 测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液） 作空白对照，在紫外分光度计上直接读取 280nm 的吸光度值 A280。蛋白质浓度可控制在 0.1

39、 1.0mg/ml 左右。通常用 1cm 光径的标准石英比色皿，盛有浓度为 1mg/ml 的蛋白质溶液时 ，A280 约为 1.0 左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1 1cm ）有文献数据可查，根据此光 吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A11cm）值（即蛋白 质溶液浓度为 1%，光径为 1cm 时的光吸收值）的关系。文献值 A11cm, 称为百分吸收 系数或比吸收系数。 蛋白质浓度 = (A28010 )/ A11cm,280nm (mg/ml) (Q 1%浓度10mg/ml) 2. 280nm 和 260nm

40、的吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收，在 280nm 处的吸收比蛋白质强 10 倍（每克），但核酸在 260 nm 处的吸收更强，其吸收高峰在 260nm 附近。核酸 260nm 处的消光系数是 280nm 处的 2 倍，而蛋白质则相反，280nm 紫外吸收值大于 260nm 的吸收值。通常： 纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 1.8 纯核酸的光吸收比值： A280/A260 0.5 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其 A280 和 A260，由此吸收差值，用下面的经验公式 ，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45A2800.74A260 (mg/ml) 此经验公式是通过一系列已

41、知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸 ）的混合液所测定的数据来建立的。 3. 215nm 与 225nm 的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用 280nm 的光吸收测定时，可用 215nm 与 225nm 吸 收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 用已知浓度的标准蛋白质，配制成 20100 mg/ml 的一系列 5.0ml 的蛋白质溶液，分别测 定 215nm 和 225nm 的吸光度值，并计算出吸收差： 吸收差 D= A215 A225 以吸收差 D 为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差， 即可由标准曲线上查出未知样品的

42、蛋白质浓度。 本方法在蛋白质浓度 20100mg/ml 范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4） 2SO4 以及 0.1M 磷酸、硼酸和 Tris 等缓冲液，都无显著干扰作用，但是 0.1N NaOH, 0.1M 乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的 215nm 光吸收值较大，必须将其浓度降到 0.005M 以下才无显著影响。 4. 肽键测定法 蛋白质溶液在 238nm 处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶 液配制一系列 50500mg/ml 已知浓度的 5.0ml 蛋白质溶液，测定 238nm 的光吸收值 A238 ，以 A238 为纵座标, 蛋白

43、质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准 曲线求得。 进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用 238nm 检测蛋白质的峰位。 本方法比 280nm 吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧 化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂， 可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。 血浆游离血红蛋白测定 血红蛋白具有类过氧化物酶活性，可催化 H2O2 释放新生态氧，使邻甲联苯胺氧化发生 颜色变化，由无色最终变为蓝 紫色。根据 显色深浅与标准进 行比较，可测出其含量。 实验方法 材料：

44、12g/L 邻甲联 实验原理 血红蛋白具有类过氧化物酶活性，可催化 H2O2 释放新生态氧，使邻甲联苯胺氧化发生颜 色变化，由无色最终变为蓝紫色。根据显色深浅与标准进行比较，可测出其含量。 实验方法 材料： 12g/L 邻甲联苯胺溶液 21%H2O2 310%醋酸溶液 4分光光度计 方法： 1.抽取静脉血 2-3ml，枸橼酸钠抗凝，离心分离血浆。 2按下表进行操作，用分光光度计，波长为 530nm，以空白管调零，测定测定管的吸光度。 试剂 （ml） 测定管 空白管 2 g/L 邻甲联苯胺溶液 0.5 0.5 患者血浆 0.02 / 1% H2O2 0.5 0.5 混匀后室温放置 10min 10%醋酸溶液 5.0 5.0 室温放置 10min 3.计算公式 血浆游离 Hb(mg/L)=测定管吸光度/ 标准管吸光度100 实验结果计算 参考范围：0-40mg/L 注意事项 1.一切容器避免血红蛋白污染； 2.采血要顺利，器皿要干燥，检测血浆要新鲜，及时分离，防止人为溶血； 3.邻联苯胺溶液具致癌性，检测时要小心，废液要妥善处理，以免污染； 4.双氧水要新鲜配置，浓度要准确。