生物化学实验参考答案.doc

1、生物化学实验总复习思考题部分是自己做的，部分是百度的，各位看官如果要借鉴请酌情考虑，后果自负。 江湖游子1. 请掌握下列生物化学实验常用仪器的正确操作使用方法，并能回答以下问题：（1）离心机使用时为什么要平衡？普通离心机与高速离心机在平衡时有什么不同要求？平衡是为了让转动物体重心正好在转轴上，如果不在，会对转轴产生很大作用力，有时整台机器会跟着晃动。这对机器损耗很大。转速越高的离心机不光重量很重，使用时还要特别放平衡，就连离心管里面的试液都要放置等量，离心管还要对称放入转子试管孔内，以确保转子平衡运行，而且在调节转速时，还要使用分段升速法。(2)为什么用高速组织捣碎机进行动、植物组织捣碎时，需

2、采用间歇式方式进行操作？为了防止产热过高，破坏组织内的蛋白质。防止蛋白变性。(3)用真空泵进行减压抽滤时，为什么要连接缓冲瓶？防止负压产生，引起水泵里的水或油泵里的油倒吸，进入滤瓶中，污染滤液。2. 为什么肝糖元只能从刚宰杀的动物肝脏中获取？在提取肝糖元过程中，三氯乙酸、95%乙醇各起什么作用？糖元水解产物中如果存在提取中残留蛋白质时，在用班氏试剂检测水解产物，有什么影响！动物死亡后，体内的细胞还能存活一段时间，由于进行细胞呼吸作用，肝细胞会消耗肝糖元，所以必须用新鲜的肝脏细胞。三氯乙酸是固定作用（蛋白质能被三氯乙酸沉淀）；乙醇：糖元不溶于乙醇，可以提取糖元。班氏试剂使用时需要加热，而加热会时

3、残留的蛋白质变性水解，对最终测得的水解产物颜色可能有影响。（水解的产生的氨气结合铜离子，是铜离子的氧化性失去，导致生产绛蓝色沉淀，实验将失败）3. 请阐述分光光度仪的主要部件及其功能；阐述紫外与可见光的光波长范围；在紫外与可见光范围内测定物质吸光度时，对光源与吸收池有何要求？光电管的功能是什么？为什么说光电管是分光光度仪最脆弱和最易损的部件？ 光源（钨灯）：发光。单色器：把混合光波分解为单一波长光的装置。吸收池：盛放待测流体（液体、气体）试样的容器。该容器应具有两面互相平行、透光且有精确厚度的平面。它藉助机械操作能把待测试样间断或连续地送到光路中，以便吸收测量的辐射（光）通量。检测器：将单色器

4、分出的光信号进行光电转换，电信号在工作站显示成出峰。测量装置：通过测得的电流表记录器数字示值读书单元的数据来绘制吸收曲线。紫外光：200至350nm可见光波长:350至760nm紫外测定：其应用波长范围为200400nm的紫外光做光源，在低于350nm的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。可见光测定：用波长为400850nm的可见光作光源，可以用玻璃池石英池熔凝池。光电管的功能：光电转换，将光信号转化成电信号。光电管容易产生光电管疲劳：所以不测定时必须将试样室盖盖好，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。4. 请阐述Beer-Lamber定律，并用该定律阐述分光光度仪工作原理？用分光光度

5、仪定制某物质标准曲线时，需将OD值测定范围确定在0.20.8区域内，为什么？（这题没找到答案，自己写的）朗伯(Lambert)定律阐述为：光被透明介质吸收的比例与入射光的强度无关；在光程上每等厚层介质吸收相同比例值的光。 比尔(Beer)定律阐述为：光被吸收的量正比于光程中产生光吸收的分子数目。 log( Io/I)= Cl (14) 式中 Io和I分别为入射光及通过样品后的透射光强度；log（Io/I）称为吸光度(absorbance)旧称光密度(optical density)；C为样品浓度；l为光程；为光被吸收的比例系数。当浓度采用摩尔浓度时，为摩尔吸收系数。它与吸收物质的性质及入射光的

6、波长有关。工作原理：通过测得的吸光度，带入Beer-Lamber定律，可以求得该物质的浓度；通过确定该物质的最大吸收波长，可以确定该物质的种类。OD值小于0.2时，底物浓度低，误差大；OD值大于1时，线性关系不好，所以取0.2到0.8.5. 可以用来进行分析测定用的标准品应具备哪些特性？普通性，纯度高（工业纯，化学成分单一，分析纯，光谱纯，食品纯），理化性质稳定，含量准确，杂质无影响。 6. 请阐述移液管与比色皿的正确清洗方法和放置方法；阐述移液管取样与比色皿加样的正确操作方式和操作注意事项。移液管：移液管清洗要根据吸取液体的性质选用不同的清洗剂，有机液体可用丙酮、乙醇溶液，无机试剂可用洗涤剂

7、。应反复清洗数次，再用蒸馏水清洗干净，自然凉干。标志：内壁不挂水珠。干净的移液管应置于干净的一夜管架上，先竖着放，等水分干后横着放。比色皿：用铬酸侵泡一段时间后，将铬酸倒回试剂瓶，再用清水冲洗比色皿。使用时，要让光穿过透光面，测定完毕放到盒里时要让磨砂面向上，清洗后放置时，倒置于滤纸上。移液管取样：根据所移溶液的体积和要求选择合适规格的移液管使用，在滴定分析中准确移取溶液一般使用移液管，反应需控制试液加入量时一般使用吸量管。检查移液管的管口和尖嘴有无破损，若有破损则不能使用;1、使用前：使用移液管，首先要看一下移液管标记、准确度等级、刻度标线位置等。使用移液管前，应先用铬酸洗液润洗，以除去管内

8、壁的油污。然后用自来水冲洗残留的洗液，再用蒸馏水洗净。洗净后的移液管内壁应不挂水珠。移取溶液前，应先用滤纸将移液管末端内外的水吸干，然后用欲移取的溶液涮洗管壁2至3次，以确保所移取溶液的浓度不变。2、吸液： 摇匀待吸溶液，将待吸溶液倒一小部分于一洗净并干燥的小烧杯中，用滤纸将清洗过的移液管尖端内外的水分吸干，并插入小烧杯中吸取溶液，当吸至移液管容量的1/3时，立即用右手食指按住管口，取出，横持并转动移液管，使溶液流遍全管内壁，将溶液从下端尖口处排入废液杯内。如此操作，润洗了3-4次后即可吸取溶液。将用待吸液润洗过的移液管插入待吸液面下12cm处用吸耳球按上述操作方法吸取溶液(注意移液管插入溶液

9、不能太深，并要边吸边往下插入，始终保持此深度)。当管内液面上升至标线以上约12cm处时，迅速用右手食指堵住管口(此时若溶液下落至标线以下，应重新吸取)，将移液管提出待吸液面，并使管尖端接触待吸液容器内壁片刻后提起，用滤纸擦干移液管或吸量管下端粘附的少量溶液。(在移动移液管或吸量管时，应将移液管或吸量管保持垂直，不能倾斜)3、调节液面：左手另取一干净小烧杯，将移液管管尖紧靠小烧杯内壁，小烧杯保持倾斜，使移液管保持垂直，刻度线和视线保持水平(左手不能接触移液管)。稍稍松开食指(可微微转动移液管或吸量管)，使管内溶液慢慢从下口流出，液面将至刻度线时，按紧右手食指，停顿片刻，再按上法将溶液的弯月面底线

10、放至与标线上缘相切为止，立即用食指压紧管口。将尖口处紧靠烧杯内壁，向烧杯口移动少许，去掉尖口处的液滴。将移液管或吸量管小心移至承接溶液的容器中。4、放出溶液：将移液管或吸量管直立，接受器倾斜，管下端紧靠接受器内壁，放开食指，让溶液沿接受器内壁流下，管内溶液流完后，保持放液状态停留15s，将移液管或吸量管尖端在接受器靠点处靠壁前后小距离滑动几下(或将移液管尖端靠接受器内壁旋转一周)，移走移液管(残留在管尖内壁处的少量溶液，不可用外力强使其流出，因校准移液管或吸量管时，已考虑了尖端内壁处保留溶液的体积。除在管身上标有“吹”字的，可用吸耳球吹出，不允许保留)。5.洗净移液管，放置在移液管架上。注意事

11、项：1.移液管(吸量管)不应在烘箱中烘干。2.移液管(吸量管)不能移取太热或太冷的溶液。3.同一实验中应尽可能使用同一支移液管。4.移液管提出液面后，应用滤纸将沾在移液管外壁的液体擦掉;5.看刻度时，应将移液管的刻度与眼睛平行，以最下面的弯月面为准。6.移液管在使用完毕后，应立即用自来水及蒸馏水冲洗干净，置于移液管架上。7.移液管和容量瓶常配合使用，因此在使用前常作两者的相对体积校准。8.在使用吸量管时，为了减少测量误差，每次都应从最上面刻度(0刻度)处为起始点，往下放出所需体积的溶液，而不是需要多少体积就吸取多少体积。比色皿加样：手持干净的比色皿粗糙面，将装有溶液的试剂瓶口紧靠比色皿内部，缓

12、缓倒出液体，液体大约占全部的三分之二时，停止倒入，试剂瓶口紧靠比色皿口微提防止溶液倒出。并用吸水纸擦干。注意事项：1、拿取比色皿时,只能用手指接触两侧的毛玻璃,避免接触光学面。同时注意轻拿轻放，防止外力对比色皿的影响，产生应力后破损。 2、凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液,不得长期盛放在比色皿中。 3、不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤;。 4、当发现比色皿里面被污染后，应用无水乙醇清洗，及时擦拭干净。 5、不得将比色皿的透光面与硬物或脏物接触。盛装溶液时,高度为比色皿的2/3处即可,光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用镜头纸或丝绸擦拭。7. 请阐述“黑体”与“参比”在分光光度

13、仪校正中的作用，以及正确的校正操作方法；（以7200型可见光分光光度仪，用DNS法测定还原糖为例，说明如何进行“黑体”与“参比”的校正操作？）黑体校正作用：完全挡住光线，使透光度调零。黑体校正：调到T档，使透光率为0%。参比校正作用：消除DNS的颜色对测定的影响。参比校正：调到A或T档校正都可，A档调0%，T档调100%。8. 请阐述用分光光度法测定物质含量的基本操作步骤；并请阐述“两表一图”的含义。1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱，预热十分钟。2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到零时，需选用较高档）3.根据所需要测定的波长选择波长范围档4.将空白液及待测液分别导入比色杯

14、34处，用擦镜纸擦干净外币，放入样品室，将空白管对准光路。5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，是读数盘指针指向“0”处。6.盖上暗箱盖调节“100”调节器，是空白管的T=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿分别读出测定管的光密度值，并记录。7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦干净。两表一图：一表为标准品吸光度随浓度变化的关系，一表为待测样吸光度随浓度变化的关系。在最大吸收波长下，吸光度从0.2到0.8对应的浓度范围换算出线性回归方程，为测定该物质含量提供理论依据。9. 用分光光度仪定制标准曲线时，需用一对比色皿，一只用于盛参比液，另一只用于盛不同浓度的标准溶液，在使用时

15、，这两只比色皿之间需要进行校正吗？为什么？如何校正？需要，每测定一次不同浓度的待测液后都需要从新校正。防止每次微小的系统误差和光线温度等对仪器的影响。每测定一次待测溶液后，先拉到黑体位置，调节透光度为0:；再拉到参比液位置，将吸光度调为0.10. 什么叫物质的特征吸收波长？用分光光度法定制实测物质标准曲线时，如何确定被测物质的特征吸收波长？特征吸收波长：吸光度最大时所对应的波长。将待测液在不同的波长下测量，做出波长与吸光度的曲线。曲线峰值所对应的波长即为物质最大吸收波长。11. 用微机绘制标准曲线，确定回归方程、判断线性关系好坏时，需用到三个统计学函数。请写出这三个函数的完整表达式。不会12.

16、 标准曲线的绘制有哪几大要素？（曲线名称、纵横坐标轴的名称及单位、正方型网格线、图例、标准曲线与实验各散点的平滑连线）13. 需借助显色反应来进行标准曲线定制时，显色反应试剂与标准品用量上应注意什么关系？显色试剂远远过量14. 通过测定样品待测液OD值，由标准曲线对应的回归方程计算待测液显色浓度时，样品待测液OD值测定的大小值应控制在什么范围内？0.2到0.815. 正确理解样品待测液显色浓度、样品待测液浓度与样品实际浓度三个基本概念，理解三者之间的关系。以实验讲义中，Folin酚测定人体血清蛋白含量为例，说明人体血清蛋白显色浓度是如何测定的，它与血清蛋白待测液浓度以及血清蛋白实际浓度三者存在

17、什么关系。先用标准品做出标准曲线，并测得人体血清蛋白的吸光度值，取平均后再代入所制定的标准曲线方程，即可计算出人体血清蛋白的显色浓度。关系：待测大于显色大于实质。16. 在中性脂肪的皂化实验中，为什么用NaOH-C2H5OH液作皂化剂而不用NaOH-H2O溶液作皂化剂？脂肪在水中的溶解度远小于乙醇中的溶解度。用NaOH-H2O溶液作皂化剂会导致脂肪溶解度过小而引起水解效率过低。17. 请阐述中性脂肪水解反应有哪三个主要途径？其对应的生成物是什么？请阐述加酶洗衣粉的洗涤原理及洗涤时的水温要求。酸水解，碱水解，脂肪酶水解。产物：甘油，脂肪酸钠。酶是生物催化剂，可以催化油脂分解并快速溶解，使洗涤效果

18、更好。酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速率最高。18. 请阐述蛋白质双缩脲反应的原理，双缩脲反应的应用；为什么用尿素进行双缩脲反应必需用干燥试管才能得到正确的反应结果？书92页19. 请阐述茚三酮反应的反应原理及其应用。书93页20. 请阐述蛋白质“盐析”与“中性有机溶剂沉淀蛋白质”反应原理；这两类沉淀反应有何应用？盐析：用大量中性盐使蛋白质从其胶体溶液中析出的过程为蛋白质的盐析作用。应用：分级分离，提纯蛋白质。中性有机溶剂：有机溶剂有强合水作用，使蛋白质分子脱水，破坏蛋白质的水化层，降低其在水溶液中的稳定性，而形成沉淀。应用：提纯蛋白质。21. 在蛋白质不可逆沉淀反应实验中，

19、多次涉及到蛋白质遇到沉淀剂后，沉淀不增加反而消失的现象，这一现象统称为“假溶”现象，蛋白质的“假溶”与“复溶”两者之间有什么本质上的不同？并请解释以下“假溶”现象：假溶指蛋白质已变性后，因溶液或酸或碱而带同种电荷，使蛋白质分子间产生排斥，从而溶解。复溶指蛋白质因溶液酸碱度，轻金属离子等一起溶解度降低的现像，在消除这些因素后，蛋白质能回到原样从而复溶。此过程蛋白质未变性。（1） 在重金属盐沉淀蛋白质实验中，加入过量的硫酸铜或过量的乙酸铅后，沉淀消失现象？过量的硫酸铜（醋酸铅）中的铜（铅）离子会吸附在蛋白质表面从而使蛋白质带电而是蛋白质分子间相互排斥，最终发生假溶现象。（2） 在“海伦压环”试验中

20、；请解释用浓硫酸与浓盐酸进行海伦压环试验振荡后，沉淀消失现象？浓硫酸和浓盐酸中含有大量的氢离子，氢离子吸附在蛋白质表面使蛋白质带电，也能发生假溶现象。22. 请阐述用透析试验验证蛋白质“可逆”与“不可逆沉淀反应”的实验设计原理。书101。透析法：透析袋能使小分子运动出去，而大分子蛋白质不能。若果透析后蛋白质复性则为可逆沉淀，未复性则为不可逆。23. 请阐述酸、碱、盐的存在对加热变性蛋白质沉淀反应有何影响。要求能对加热变性沉淀蛋白质实验中涉及到的每个实验现象作出正确的理论解释。沉淀溶解，解释：参照假溶现象。24. 请阐述电泳基本概念，常用电泳方法的分类及其应用。书32.25. 请阐述全血，血浆与

21、血清基本概念。略26. 请阐述人体血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳原理，通过人体血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳，可以将人体血清蛋白分为哪几类？分离测定各血清蛋白相对百分含量对于医学临床诊断疾病有何指导意义？书13127.为什么人体血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳适宜在pH=8.6的弱碱性缓冲液中进行电泳分离，而不适宜在弱酸性缓冲液中电泳？书131页，实验原理第二段。28. 请阐述在电泳实验中，电场强度、电泳缓冲溶液pH、缓冲溶液的离子强度对被分离物质有何影响?电场强度：电泳速度缓冲液PH：蛋白质带电多少，从而影响电泳速度。缓冲液离子强度：溶液的离子强度电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电质点

22、吸引相反符合的离子聚集其周围，形成一个与运动质点符合相反的离子氛（ionic atmosphere），离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关。可用离子强度I表示。29. 在电泳中“虹吸现象”是如何发生的？“虹吸现象”对电泳有何影响？如何在电泳实验操作中尽量避免“虹吸现象”发生？虹吸现象是液态分子间引力与位差能造成的。（如薄膜的干湿程度不同，点样时操作不精确，电泳时薄膜未平衡等）影响：在某区域发生虹吸现象会使这里电泳时蛋白质分

23、子在电场中运动速度改变，从而时薄膜上的蛋白质分布不均匀准确，影响测量结果。挑选薄膜是一定要挑光滑，质地均匀，无斑点，能迅速润湿的。点样精确均匀，并且架空式不能使薄膜接触桌面。电泳之前一定要平衡。30. 列表详尽阐述在血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验操作中，下列试剂及器材的作用：（1） 三层滤纸（作盐桥）；（2）厚型载玻片（架空，使薄膜点样悬空）；（3） pH8.6的电泳缓冲液（时蛋白质带同种电荷）；（4）10B氨基黑染色液（固定染色蛋白质）；（5）冰乙酸-乙醇漂洗液（洗去薄膜上不含蛋白质的染料）（6）0.4moL/L的NaOH溶液（洗去蛋白质上的染料）？31. 请阐述Folin酚法定制蛋白质标准曲

24、线的原理；对比双缩脲定制蛋白质标准曲线原理和方法，列表从标准品的使用浓度，测定范围，反应灵敏度，标准品的用量，线性关系的好坏比较两种测定蛋白质方法的优、缺点。（略）32. 请阐述考马斯亮蓝G250染色法定制蛋白质标准曲线的原理；对比Folin酚定制蛋白质标准曲线原理和方法，列表从标准品的使用浓度，测定范围，反应灵敏度，标准品的用量，线性关系的好坏比较两种测定蛋白质方法的优、缺点。（略）33. 请从检测方法的原理与应用范围着手分析，为什么分别采用Folin酚法和双缩脲法测定“蛋白胨”这种微生物培养基质中蛋白含量时，其测定出的蛋白含量检测结果会大相径庭，相差甚远？从测定特点去分析，一个能测定水解蛋

25、白，一个不能。相关资料：蛋白胨是有机化合物。蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。在胃内蛋白质的初步消化产物之一就是蛋白胨。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。它可以作为微生物培养基的主要原料，在抗生素、医药工业、发酵工业、生化制品及微生物学科研等领域中的用量均很大，可以用来治疗消化道疾病；不同的生物体需要特定的氨基酸和多肽，因此存在着各种蛋白胨，一般来说，用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（酪蛋白、肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。 34. 在考马斯亮蓝G250染色法定制蛋白质标准曲线实

26、验准备中，考马斯亮蓝G250试剂配制中往往因试剂的酸度、试剂过滤的清澈度、试剂质量本身等诸多因素，影响试剂配制的准确性。从而直接影响其标准曲线定制的准确性，因此常常需要对配制好的试剂进行准确度测定，请你结合该方法的检测灵敏度，阐述验证试剂配制准确性的有效检测方法。（以实例进行阐述）根据：在测定液中含5ug/ml时就有0.275的吸光度变化。从不同浓度（等差关系）的蛋白质对应的吸光度（等差关系）比较，可以设计检测方法。35. 测定食品中蛋白质含量的传统方法是什么？请阐述该方法的检测原理。三聚氰胺事件发生后，该检测方法暴露出了一个重大缺陷，请分析导致该缺陷的原因，并根据你所学知识，推荐一种测定食品

27、中蛋白含量的准确方法，并说明其方法在实际应用中的优点。略，书118页。36. 为什么在提取唾液淀粉酶前，必需将口中的残渣用清水漱尽后，才能满足实验需要，正确提取淀粉酶？否则会对酶的什么验证实验造成不利影响？食物残渣也会分解，影响实验结果。37. 请结合实验教学内容，阐述酶的专一性验证实验设计原理。略。书147页38.为什么淀粉的水解进行程度可以通过碘滴反应加以确定。提示：淀粉遇碘变蓝。38. 在进行酶的激活剂与抑制剂实验中，加入Na2SO4的目的与意义。氯化钠为唾液淀粉酶的激活剂，硫酸铜是抑制剂。加入Na2SO4的目的是改变溶液中的离子浓度而判断什么离子是激活剂，什么离子是抑制剂。39. 请结合你所学的酶的相关知识，正确地分析在医学临床上，下列医学手段应用的理论基础是什么？（1） 对于实施大型手术的患者，往往在手术进行中，医生要对患者实施低温麻痹术，其作用是什么？提示：细胞活性（2） 对于“ICU”监护室中生命体征极弱患者，常常采用“冬眠疗法”进行救治，其依据是什么？降低生命机能消耗，不就和打坐时一回事么。晕！生物产业学院生物化学实验主讲教师：徐文俊2009-12-20 生物产业学院食品质量安全2班刘霄鹏做 1班唐晓慧改有所改动，改动题为：2,3，5,7,15,17,20,22,30,38.