猪传染病诊断技术进展.ppt

1、30年来我国猪病发展变化与根治展望,何启盖 教授，陈焕春 院士 华中农业大学动物医学院武汉，430070,取得的成绩,感谢几代兽医科学家的努力，提高了我国动物疾病控制水平疫苗：我国生物制品数量达到200多种，其中某些弱毒疫苗达到了世界先进水平。 猪伪狂犬基因缺失疫苗，猪大肠杆菌病的基因工程疫苗已开始推广应用。一批简便适用的诊断试剂研制成功促进了养猪业的健康发展,主要内容,1、近年来我国猪病发展变化 多病原混合感染 病原毒力增强 疾病种类增加：老病没有消灭，新病增加 2、根治展望 消费者因素；养猪企业自身需求； 兽医生物制品研发技术的进步； 国际交流；法律法规保障,一、猪病发展变化,1、单纯感染

2、向多病原混合感染发展细菌之间： 波氏杆菌产毒性巴氏杆菌病毒之间： 猪瘟伪狂犬病毒混合感染细菌病毒： 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 + 副猪嗜血杆菌 / 胸膜肺炎放线杆菌 / 链球菌,猪呼吸道综合症(PRDC), 猪高热综合症 ？,A. 免疫抑制疾病： 伪狂犬病 / 蓝耳病 / 圆环病毒. 破坏淋巴细胞,降低免疫力，使继发感染容易发生B. 病原之间相互作用 PRRSV + 细菌毒素C. 使用霉变饲料,（2）病原毒力发生变异或增强,圆环病毒: PCV2b的毒力大于PCV2a 原因：在PCV2a基因组的1042核甘酸发生胸苷激酶 ( Thymidine, T)的缺失即为PCV2b。 猪呼吸与繁殖障碍综

3、合征病毒 Nsp2基因的部分缺失 ORF5基因糖基化位点的增加,Kegong Tian1*，June，2007,30个氨基酸缺失,（3）疾病种类增加,老病得到有效控制 猪瘟 猪丹毒，黄白痢（大肠杆菌） 猪肺疫，仔猪副伤寒 伪狂犬病新病增加 传染性胸膜肺炎 副猪嗜血杆菌病 蓝耳病， 圆环病毒.,A.种猪流动频繁B.诊断技术更新水平提高明确疾病的种类,二、猪病根治展望,(1) 公众因素: 消费者食品安全的需求对猪病控制提出了更高的要求; 药物残留 人兽共患病病原: 链球菌2型;乙型脑炎(2) 企业内部因素: 经济效益的驱动，使猪病控制成为企业自身的追求；,(3) 高效疫苗的研发和使用,常规疫苗的改

4、进 猪瘟疫苗: 细胞疫苗和脾淋苗,提高免疫剂量. 口蹄疫双价苗: 传染性胃肠炎-流行性腹泻双价苗 多血清型病原所致疾病 传染性胸膜肺炎三价疫苗(血清型1,2,7) 副猪嗜血杆菌双价疫苗(血清4和5型) 猪链球菌灭活疫苗,基因(缺失)工程疫苗,伪狂犬病基因缺失疫苗 以该疫苗株为活载体构建的多价基因工程疫苗 伪狂犬病+乙型脑炎 细小病毒 口蹄疫(VP1) 蓝耳病,细菌基因工程疫苗,胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗 以此疫苗株为载体的呼吸道疾病多价基因工程疫苗沙门氏菌为载体的预防腹泻疾病的多价疫苗,(4)诊断技术进展,明确所发生的疾病 种类：传染性因素：细菌、病毒、支原体、其它微生物； 非传染性因素 单纯感

5、染 /混合感染 是否为人兽共患病利于制定及时合理的控制方案,诊断方法包含:,流行病学方法病理组织观察血清学检测病原学检测分子生物学检测,抗体检测方法血清学,凝集性反应沉淀性反应标记抗体技术有补体参与的反应中和反应,检测的目的,免疫状况评估： 定性或定量测定免疫抗体水平诊断疾病： 区分疫苗免疫动物和自然感染动物；,常用的诊断方法,快速诊断：适用于个体诊断 平板凝集试验： 乳胶凝集试验： 免疫胶体金技术大量样品筛选： 酶联免疫吸附试验（ELISA）,平板凝集试验,培养的菌体灭活后直接与血清混合，观察是否出现凝集颗粒，判定阴阳性。,乳胶颗粒（不同直径大小）,www.hull.ac.uk/scg/bi

6、nks/Desforges%20project.htm, 伪狂犬病 细小病毒 乙型脑炎,www.rpi.edu/./COURSES/NANO/renzo/nano2.html,www.medicine.uiowa.edu/./modules.asp?testID=11,技术特点3-5分钟出现结果实验条件简单，操作容易，样品处理量大。适合于动物伪狂犬病毒感染的早期检测 乳胶凝集的阴性和阳性反应,阳性结果,阴性结果,颗粒聚于液体边缘,透明,呈原有的均匀乳状,胶体金检测技术,酶联免疫吸附试验,将病毒、纯化的蛋白质等抗原包被在酶联板上，通过间接法、竞争法等程序检测抗体。,用 途,免疫(感染)抗体检测：

7、 伪狂犬病抗体检测（gB-ELISA, PrV-ELISA, 中和试验,免疫荧光) 猪呼吸与繁殖障碍综合症：ELISA和IFA区分疫苗免疫与自然感染猪 伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断盒 传染性胸膜肺炎ApxIV-ELISA鉴别诊断 口蹄疫3ABC-ELISA鉴别诊断试剂盒,鉴别诊断的原理,伪狂犬病： gE基因缺失后，gE抗体不能在gE基因缺失疫苗免疫动物中检测，而野毒感染猪可产生此抗体；传染性胸膜肺炎 毒素IV仅在感染动物体内表达，并诱导动物产生抗体，灭活苗不含有毒素IV,所以免疫动物不能产生针对毒素IV的抗体；口蹄疫: 口蹄疫病毒NS1为非结构蛋白，仅在病毒复制时产生；在灭活苗中不存在（或

8、含量低），动物免疫后体内不产生抗NS1抗体，但活病毒感染动物可产生此类抗体。,抗原捕获酶联免疫吸附试验适用于大规模样本病毒抗原的检测, Pierson,发展高通量的检测技术基因芯片技术,（DNA microarrays, DNA chips）,杂交(病毒检测)结果,HZ-VP1-2A-3D,SX-VP1-2A-3D,DQ-VP1-2A-3D,LI-VP1-2A-3D,在PCR仪中热稳定的DNA聚合酶可使短链的双股靶DNA很快地复制成千上万倍，可以使DNA数量急剧增长而达到检测极限。理论上，可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。,聚合酶链反应（

9、PCR）技术：,检测猪呼吸道5种病原菌PCR方法,引物设计,检测猪呼吸道5种病原菌PCR方法,Bb Mhp App,Pm Hps,PRRSV-HCV-JEV 多重PCR,6、7、9 号血清样品为PRSSV变异株单一感染；11，12号样品为常规毒株和变异毒株混合感染；1，2，4，5，8，10，13，14，15号样品为PRRSV常规毒株单一感染；3，16号样品为阴性,部分ORF-7 RT-PCR 阳性样品中，变异毒株的检出情况,多重PCR用途：,单独感染多病原混合感染 胸膜肺炎副猪嗜血杆菌巴氏杆菌支原体混合感染 伪狂犬病细小病毒圆环病毒感染 猪瘟蓝耳病乙型脑炎病毒感染,繁殖障碍的多重PCR,对流产

10、死胎进行检测对公猪精液进行实时监控,(5) 加强国际交流，结合我国实际情况，消化吸收国际先进经验,制订长期的防疫规划 对一些危害严重的畜禽传染病制订长期的防疫规划，达到最后消灭的目标。如美国通过制订防疫规划，自1962年至1976年经过14年的努力，终于消灭猪瘟，就是一个成功的经验。,我国的猪瘟伪狂犬病根除与净化计划已经启动,（6）.法律法规保障,2007年8月30日第十届全国人民代表大会常务委员会第二十九次会议修订 新的中华人民共和国动物防疫法将于2008年1月1号实施，为动物疾病（包含猪病）的预防提供了法律保障,全国人大法律委员会副主任委员王以铭作关于中华人民共和国动物防疫法（修订草案）审

11、议结果的报告。中新社发廖文静 摄,修订的动物防疫法,第一章总则 第二章动物疫病的预防 第三章动物疫情的报告、通报和公布 第四章动物疫病的控制和扑灭 第五章动物和动物产品的检疫 第六章动物诊疗 第七章监督管理 第八章保障措施 第九章法律责任 第十章附则,猪病类型,一类动物疫病 口蹄疫、猪水泡病、猪瘟、非洲猪瘟二类动物疫病： 猪乙型脑炎、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合症、猪丹毒、猪肺疫、猪链球菌病、猪传染性萎缩性鼻炎、猪支原体肺炎、旋毛虫病、猪囊尾蚴病二类动物疫病： 猪病：猪传染性胃肠炎、猪副伤寒、猪密螺旋体痢疾 ,猪病控制净化的前景,前途是光明，道路是曲折的。需要全社会的共同努力感谢对兽医行业的支持,鸣谢,国家“十一五”科技支撑计划-疫苗免疫与感染动物以及猪多病原混合感染鉴别诊断试剂盒研制国家“十一五”科技支撑计划猪瘟伪狂犬病根除计划集成与示范教育部-新世纪优秀人才资助计划-副猪嗜血杆菌研究教育部留学回国人员科研启动基金-胸膜肺炎-支原体双价基因工程疫苗研究863课题-细菌基因工程疫苗研究（20062010）湖北省十一五攻关-猪传染性胸膜肺炎综合防治,谢 谢！,