放线菌SZ-01的分离鉴定及产活性物质的性质研究.doc

1、本科生毕业论文（设计）题目放线菌SZ01的分离鉴定及其活性物质的性质研究姓名学号2011413320院系生命科学学院专业生物技术专业指导教师职称副教授2015年5月18日曲阜师范大学教务处制摘要1关键词1ABSTRACT1KEYWORD2引言21材料与方法211菌株筛选212敏感菌株313培养基314放线菌对不同敏感菌的抑制作用的研究3141制备菌悬液3141测定抑菌圈315菌株鉴定4151培养特征和形态特征观察4153生理生化特性分析4153分子生物学鉴定及细胞壁类型分析616产活性物质的性质鉴定6161发酵液的预处理6162处理后发酵液稳定性76163抑菌物质萃取7164发酵液再处理72结

2、果与分析721菌株筛选及抗菌活性测定722菌株鉴定7221放线菌SZ01在不同培养基上生长情况见表3。8222生理生化特性分析放线菌SZ01各种生理生化特征见表48223分子生物学鉴定及细胞壁成分分析823处理后发酵液的稳定性9231热稳定性9232紫外稳定性10233酸碱稳定性1124有机溶剂对活性物质的萃取113结果与讨论12致谢12参考文献12放线菌SZ01的分离鉴定及产活性物质的性质研究生物技术专业指导老师摘要本文主要是对微山湖样品采集地湖底淤泥中的放线菌的其中的一株SZ01进行分离鉴定及产的活性物质的性质的研究。通过对其形态学特征、生理生化特征、细胞壁成分及16SRDNA的分析，发现

3、该菌的16SRDNA与产红色链霉菌淡紫链霉菌的相似性较高，达到99，根据聚类分析该放线菌SZ01应该为产红色链霉菌的变种。放线菌SZ01的发酵液经PH分别2、4、6、8、10、12的溶液处理后活性物质的抑菌活性几乎不变；将发酵液置于紫外灯光下分别照射20MIN，40MIN，1H，2H，3H，4H，5H，6H后，活性物质的抑菌活性几乎不变；将发酵液经高温处理，温度低于80，抑菌活性几乎不变，100处理1H，抑菌活性稍有减弱，121处理20MIN，仍具有抑菌活性，总体来说，发酵液中活性物质的稳定性较好。关键词放线菌分离鉴定活性物质STUDYONPROPERTIESOFACTINOMYCETESIS

4、OLATIONANDIDENTIFICATIONOFSZ01ANDPRODUCTIONOFACTIVESUBSTANCESSTUDENTMAJORINGINBIOTECHNOLOGYTUTORABSTRACTTHISARTICLEMAINLYCONDUCTEDAPRELIMINARYIDENTIFYANDSTUDYTOTHEACTINOMYCETESANDTHEIRANTIMICROBIALACTIVITYTHATWERECOLLECTEDFROMWEISHANLAKEBOTTOMSILTANALYSINGITSMORPHOLOGICALCHARACTERS,PHYSIOLOGICALANDB

5、IOCHEMICALCHARACTERISTICS,THECELLWALLCOMPOSITIONAND16SRDNAANALYSISTHERESULTSSHOWEDTHATTHEBACTERIUMSTREPTOMYCESERYTHROCHROMOGENESISSIMILARTOSTREPTOMYCESLAVENDULAEDANZICHAINMOULDWITH99SIMILARITIESIN16SRDNA,ANDHASSIMILARITIESOF98AND98RESPECTIVELYWITHSTREPTOMYCESFLAVOTRICINI,STREPTOMYCESGLOBOSUS,STREPTO

6、MYCESTOXYTRICINI,STREPTOMYCESBIKINIENSISINTHEASPECTACCORDINGTOTHECLUSTERINGANALYSIS,SZ01SHOULDBESTREPTOMYCESERYTHROCHROMOGENESPRODUCEREDCHAINMOULDVARIETIESACTINOMYCETESBROTHSZ01,RESPECTIVELY,BYTHEPHOFTHESOLUTIONAFTERTREATMENT2,4,6,8,10,12ANTIBACTERIALACTIVITYOFTHEACTIVESUBSTANCEISALMOSTUNCHANGEDTHEF

7、ERMENTATIONBROTHWEREPLACEDUNDERULTRAVIOLETLIGHTIRRADIATION20MIN,40MIN,1H,2H,3H,4H,5H,6H,THEANTIBACTERIALACTIVITYOFTHEACTIVESUBSTANCEISALMOSTUNCHANGEDFERMENTATIONBROTHBYHIGHTEMPERATURETREATMENT,THETEMPERATUREISBELOW80,ANTIBACTERIALACTIVITYWASALMOSTUNCHANGED,100TREATMENT1H,ANTIBACTERIALACTIVITYSLIGHTL

8、YDECREASED,121TREATMENT20MIN,STILLHASANTIBACTERIALACTIVITY,INGENERAL,THEFERMENTATIONBROTHISBETTERSTABILITYOFTHEACTIVESUBSTANCEKEYWORDSANTAGONISTICACTINOMYCETEISOLATIONANDIDENTIFICATIONACTIVESUBSTANCE放线菌是一类具有重要的实用价值和经济价值的微生物，种类繁多，是生产抗生素、维生素、酶制剂、抗寄生虫和免疫调节剂等多种生物活性物质的主要生产菌，为人类的健康以及生产生活做出了巨大贡献。目前，已知的抗生素大

9、约有80来自放线菌，其产生的抗生素具有抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、抗寄生虫等多种活性1。近年来，由于化学杀菌剂的应用带来了环境与食品安全、药物残留、药害等许多问题，使环境友好的病害生防因子越来越受到重视，生防微生物的应用日益广泛，已成为农业可持续发展的重要组成部分，开发新的持续有效的拮抗菌剂或环境友好的天然抗菌物质的需要日益迫切24。我们从微山湖湖底的淤泥中分离筛选出来的具有广谱拮抗作用的放线菌菌株SZ01，对该菌株进行形态学特征、培养性状、生理生化特征几方面的鉴定，阐明其分类地位，并对其产活性物质进行了初步的而研究。为进一步找寻及开发有价值的具生物活性的微生物提供理论依据。1材料与方法11菌株筛

10、选从山东微山县境内微山湖不同的湖底环境中采集15个湖底淤泥样品，其中南四湖6个样品，养殖区3个样品，示范区3个样品。采样时间为2011年9月，采样后样品立即置于无菌封口袋并保存于室温环境，样品运回学校后保存于4冰箱中备用，采样时要注意在袋上标注具体的采样地点、采样日期和序号等，方便以后记录。将采集到的15个淤泥样品自然风干10后各称取10G于250ML锥形瓶中，各加入90ML无菌水，再在每个锥形瓶中加入约12个小玻璃珠，于恒温振荡器中100R/MIN振荡10MIN使泥样充分混匀，即制成101浓度的悬浊液，然后从中吸取1ML悬浊液依次配制成浓度为102、103和104的稀释液备用。稀释液配制好后

11、，用移液枪各吸取102、103和104浓度的稀释液200L于高氏一号培养基（内含浓度为150MG/L的重铬酸钾和制霉菌素作为细菌和霉菌生长的抑制剂）上，使用涂布棒涂布均匀，然后将培养皿倒置于恒温培养箱中在28的条件下培养。7D左右挑取单菌落在相应的培养基上进行划线后再倒置于于恒温培养箱中28培养7D。可将此步骤多重复几遍对菌株进行高度纯化。所得纯培养物放置于20的甘油水溶液中70保存备用。采用划线分离的方法纯化，随时观察并记录菌株的原始培养结果并统一编号。根据放线菌的特征及时挑取单个放线菌菌落至高氏一号平板上，采用插片法8在高倍镜下观察放线菌基内菌丝、气生菌丝、孢子丝和孢子的形态，最终选取一株

12、编号为SZ01的放线菌对其进行研究。12敏感菌株用于抑菌试验的敏感菌株有大肠杆菌（ESCHERICHIACOLI）、金黄色葡萄球菌（STAPHYLOCOCCUSAUREUS）、黑曲霉（ASPERGILLUSNIGER）、桔青霉PENICILLIUMCITRINUM、高大毛霉（MUCORMUCEDO）和黄曲霉（ASPERGILLUSFLAVUS），短梗霉，均为本实验室保藏菌种。由于菌种长期在低温中保存，所以用之前要先进行菌种活化，并做好保种。13培养基高氏一号琼脂培养基可溶性淀粉20G，KNO31G，NACL05G，K2HPO405G，MGSO47H2O05G，FESO47H2O001G，琼脂1

13、520G，蒸馏水1000ML，PH7274。LB培养基蛋白胨10G，酵母粉5G，NACL10G，PH7274，蒸馏水1000ML种子培养基200G土豆津汁1000ML，葡萄糖20G，PH自然发酵培养基葡萄糖10G，豆饼粉10G，氯化钠25G，碳酸钙2G，蛋白胨3G，PH7274，总体积1000ML。克氏合成1号培养基磷酸氢二钾1G，碳酸镁03G氯化钠02G,硝酸钾1G，硫酸亚铁001G,碳酸钙05G,葡萄糖20察氏培养基磷酸氢二钾10G，硫酸镁05G，氯化钾05G，硝酸钠20G，硫酸亚铁001G，蔗糖250G，琼脂200G，加入蒸馏水定容至1000ML，调节PH值为7274，高压蒸汽灭菌30M

14、IN。14放线菌对不同敏感菌的抑制作用的研究141制备菌悬液取孢子悬液（约51109个/ML）200L种到种子培养基中，28摇床培养12H后，取1ML接种到发酵培养基中，28摇床培养5天后，100加热10MIN，4000RPM离心处理30MIN取上清，将上清液经微孔滤膜过滤F045M。滤液20保存备用。142测定抑菌圈先将活化培养好的指示菌种（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、产气杆菌、变形杆菌、根霉菌、青霉菌和白色念珠菌）分别接入到液体LB培养基中混合均匀，向平皿内倒入10ML高氏一号培养基制备底层培养基，待凝固后迅速倒入含有指示菌的培养基并在底层培养基上铺匀，待培养基完全凝固后在皿底

15、划“十”字并做好标记，在每个上层培养基上均匀放置已经灭菌的4个牛津杯（内直径为06CM，外直径为08CM，高度为10CM，材质为不锈钢），分别向每个牛津杯中加入02ML的发酵液，并且设置无菌水对照，将平皿放入37恒温培养箱中进行培养，并且在培养的第2D观察各组放线菌对细菌指示菌的抑制作用并测量记录抑菌圈，在培养的第4D观察对霉菌指示菌和真菌指示菌的抑制作用并测量记录抑菌圈。重复试验3次，使用十字交叉法测量出每种放线菌对指示菌的抑菌圈并求得其对每株指示菌抑菌圈的平均值进行比较。15菌株鉴定151培养特征和形态特征观察将放线菌SZ01分别接种在马铃薯块培养基、高氏合成1号琼脂培养基、察氏琼脂培养基

16、、克氏合成1号培养基、葡萄糖天门冬素琼脂培养基、淀粉琼脂培养基平板上28培养2130天观察并记录培养特征；采用插片法6观察菌株形态特征，包括菌落形态、基内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态，以及是否产生可溶性色素等。152生理生化特性分析1521放线菌水解淀粉的能力实验将放线菌SZ01分别点种在淀粉培养基上，然后倒置于28恒温培养箱中培养7D，向培养基上滴加35滴LUGOL碘液，观察是否出现透明圈，若发现透明圈则说明淀粉已被该菌体产生的淀粉酶分解，透明圈越大则表明该菌体分泌的淀粉酶的活性越高。重复试验3次。1522放线菌产生色素的能力实验制作孢子菌悬液各取100L于产色素培养基上涂布均匀，倒置于28

17、恒温培养箱中培养，在第2D、第3D、第5D和第7D分别观察培养基是否变成黑色，若是有黑色产生则表明该菌株能够产生色素。重复试验3次。1523放线菌液化明胶的能力实验使用穿刺法将放线菌SZ01接种于明胶液化培养基中，置于28恒温培养箱中培养，然后在培养的第3D、第5D、第7D、第9D、第11D和第13D依次观察明胶液化的情况，明胶呈现液体状态越多则显示该菌液化明胶的能力越强。每次观察之前需要将培养基放入4的冰箱中冷却20MIN，重复试验3次。1523放线菌产生硫化氢的能力实验同样使用穿刺法将放线菌SZ01接种于产硫化氢培养基中，置于28恒温培养箱中培养7D，取出试管观察培养基中是否有黑色反应，若

18、变成黑色则说明该菌能够产生硫化氢。重复试验3次。1524放线菌使牛奶凝固与液化的能力实验将放线菌SZ01分别接种于装有牛奶培养基的试管中，放于28恒温培养箱中进行培养，在培养的第5天、第10天和第15天分别对培养基进行观察，若牛奶中出现了固体，就称之为凝固现象，同时在培养基中若能看到透明的液体即为胨化现象，则该菌具有使牛奶凝固与液化的能力。1525放线菌使纤维素分解的能力实验将放线菌SZ01接种于水解纤维素培养基中，准备一条长为12厘米的已经灭菌的滤纸条，将滤纸条的一端浸入到培养基里，另一端绕过试管口固定于外侧，在28的条件下进行培养，在培养26D之后取出试管观察，若浸入培养基中的滤纸一端凝结

19、成块状或者出现残缺易损伤则表明该菌能够产生纤维素酶使纤维素分解。1526放线菌对不同碳源利用的能力实验将放线菌SZ01分别接入到添加了不同碳源（果糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油、半乳糖、甘露糖、木糖、棉子糖、蔗糖和淀粉）的基础培养基上，并且使用没有加过碳源的基础培养基作为对照组，培养于28的条件下，培养的第26D取出试管观察，若培养基上长出菌落则说明这种菌株对相应培养基中的碳源利用良好，若没有生长出菌落则表明该菌不能利用相应培养基中的碳源。153分子生物学鉴定及细胞壁类型分析基因组DNA的提取菌丝体的制备和DNA的提取方法参照参考文献9。以提取的DNA为模板，以16SRDNA的通用引物10上游5AG

20、AGTTTGATCCTGGCTCAG3下游5AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3进行PCR扩增。PCR反应体系DNA1L，DNTP2L，10BUFFER25L，MGCL22L，TAQ酶025L，引物125L，引物225L，DDH2OL1225LPCR参数设定94预变性5MIN；94扩增变性1MIN，525退火1MIN，72延伸2MIN，30次循环最后72延伸5MIN，4保存PCR产物利用1琼脂糖凝胶电泳检测，然后将扩增PCR产物经回收后与PMD18T连接后转化到大肠杆菌中，将大肠杆菌菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序。将测序结果与GENBANK数据库中相关放线菌菌株的16S

21、RDNA序列进行比对，确定未知种与同属的种之间的亲缘关系，并构建物种进化树。16产活性物质的性质鉴定161发酵液预处理取孢子悬液（约51109个/ML）200L种到种子培养基中，28摇床培养12H后，取1ML接种到发酵培养基中，28摇床培养5天后，100加热10MIN，4000RPM离心处理30MIN取上清，将上清液经微孔滤膜过滤F045M。滤液20保存备用。162处理后发酵液稳定性【I0】1621热稳定性分别取3ML新鲜发酵液加入到9支无菌试管中，进行如下处理40、60、80、100水浴处理30MIN和1H，121高压灭菌锅中处理20MIN,冰水中迅速冷却。以新鲜发酵液作对照，以大肠杆菌为指

22、示菌，采用管碟法测定处理后发酵液抑菌圈大小。1622紫外光照稳定性分别取4ML新鲜发酵液加入到8个小培养皿中。进行如下处理距离紫外灯20W30CM处，分别照射20MIN、40MIN、1H、2H、3H、4H、5H、6H。以新鲜发酵液作对照，以大肠杆菌为指示菌，采用管碟法测定处理后发酵液抑菌圈大小。1623酸碱稳定性分别取6ML新鲜发酵液加入到6个小培养皿中，用1MOL/LHCL和1MOL/LNAOH分别将PH调至2、4、6、8、10、12，放置1H后再将各发酵液的PH值调回到原始发酵液的PH值7，并以新鲜发酵液作对照，以大肠杆菌为指示菌，采用管碟法测定处理后发酵液抑菌圈大小。163抑菌物质萃取预

23、处理后发酵液用等体积的三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、苯进行萃取，在磁力搅拌器上搅拌4H后于分液漏斗中静置过夜，分别取上、下层，以大肠杆菌为指示菌，采用管碟法以各有机溶剂为对照测定抑菌圈大小。164发酵液再处理预处理的发酵液经旋转蒸发至原发酵液体积的1/5，再用4倍体积的乙醇洗涤沉淀10MIN，4000RPM离心处理30MIN取上清，旋转蒸发至干，取发酵液原体积的1/5的甲醇溶解蒸干物，4000RPM离心处理10MIN取上清，20保存备用。2结果与分析21菌株筛选及抗菌活性测定从微山湖湖底的淤泥中总共分离纯化得到2株菌落形态各异的放线菌，并对这21株放线菌进行抗菌活性筛选，最后获得放线菌S

24、Z01能够抑制毛霉，青霉，短梗霉等真菌，特别是对短梗霉的抑制效果最好，对细菌的抑制作用不大。记录得到每株放线菌对指示菌所产生抑制作用的平均抑菌圈直径大小结果如表1所示表1放线菌SZ01菌对各种指示菌的抑菌圈直径平均值（MM）菌种放线菌SZ01大肠杆菌236金黄色葡萄球菌205青霉213曲霉157毛霉217短梗霉25822菌株鉴定221放线菌SZ01在不同培养基上生长情况见表3。表2放线菌SZ01的培养特征培养基类型马铃薯块高氏合成1号查氏琼脂克氏合成1号葡萄糖天门冬素淀粉琼脂菌落形状近圆形圆形扁平圆形圆形扁平圆形菌落表面褶皱干燥干燥中间有突起干燥干燥中间凸起干燥干燥中间凸起菌落边缘不整齐毛发状

25、整齐整齐整齐整齐孢子堆颜色灰色灰色淡灰灰色灰白色灰色基丝颜色棕褐色灰黄色黄色黄色灰色黄色色素有无无无无无无无图一是在光学显微镜下观察到的的基内菌丝和孢子丝。图1放线菌SZ01的基内菌丝和孢子链222生理生化特性分析放线菌SZ01各种生理生化特征见表3表3放线菌SZ01生理生化实验结果223分子生物学鉴定及细胞壁成分分析16SRDNA的PCR扩增得到了一条1500BP左右的条带，见图2产色素明胶液化牛奶凝固胨化产硫化氢淀粉水解纤维素上生长碳源利用放线菌SZ01产类黑色素明胶液化凝固胨化不产不产淀粉酶生长利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖，不利用蔗糖和棉子糖图216SRDNAPCR结

26、果测序结果得到一条1521BP大小的DNA序列，将其提交到GENEBANK数据库进行BLAST比对。结果与放线菌SZ01序列相似性较高的菌株均属链霉菌，选取15株相似性最高的菌株采用CLUSTAIW软件进行序列分析，采用NEIGHBORJOINING法构建系统进化树，如图3。图3放线菌SZ0116SRDNA系统进化树从系统进化树可以看出放线菌SZ01与STREPTOMYCESLAVENDULAE、STREPTOMYCESERYTHROCHROMOGENES、STREPTOMYCESFLAVOTRICINI、STREPTOMYCESTOXYTRICINI、STREPTOMYCESGLOBOSUS

27、属于同一分支，与STREPTOMYCESERYTHROCHROMOGENES的相似性达到990，与STREPTOMYCESLAVENDULAE的相似性达到980，而与STREPTOMYCESFLAVOTRICINI、STREPTOMYCESTOXYTRICINI、STREPTOMYCESGLOBOSUS同源序列相似性也均达到980以上，参照链霉菌鉴定手册和放线菌的分类和鉴定，对上述菌株的生理生化特征的描述与放线菌SZ01生理生化特征进行对比，放线菌SZ01与STREPTOMYCESERYTHROCHROMOGENES相似性最高，但同时也存在差异。应该为STREPTOMYCESERYTHROCH

28、ROMOGENES的变种。23处理后发酵液稳定性231热稳定性如图4所示，经测定对照组发酵液抑菌圈直径为2194MM，经过40、60处理30MIN和1H后，发酵液抑菌圈直径几乎没有变化，抑菌活性没有改变，80处理3MIN和1H后发酵液抑菌活性稍有降低，抑菌圈直径降低为209MM左右，100处理30MIN和1H后发酵液抑菌圈直径降为197MM左右，121处理20MIN后发酵液抑菌活性较其他处理方式降低较大，抑菌圈直径为185MM左右，但总体来说，发酵液热处理后抑菌活性仍较大，可见发酵液的热稳定性较好。图4温度对发酵液稳定性的影响232紫外稳定性如图5所示，经测定对照组发酵液抑菌圈直径为2179M

29、M，紫外灯下照射处理20MIN、40MIN、1H、2H、3H、4H、5H、6H后发酵液抑菌圈直径仍保持在217MM左右，可见放线菌12发酵液紫外稳定性很好。151617181920212223对照20MIN40MIN1H2H3H4H5H6H时间抑菌圈直径MM图5紫外线照射时间对发酵液稳定性的影响233酸碱稳定性如图6所示，经测定对照组发酵液抑菌圈直径为2185MM，无论酸性处理调节发酵液PH为2、4、6，还是碱性处理调节发酵液PH为8、10、12，发酵液的抑菌圈直径仍为217MM左右，说明放线菌12发酵液中的活性物质在酸性和碱性条件下都非常稳定。图6不同PH对发酵液稳定性的影响24有机溶剂对活

30、性物质的萃取萃取结果见表4各种溶剂本身没有抑菌活性，抑菌圈直径是8MM为牛津杯本身直径，活性物质在原始PH条件下能被三氯甲烷和乙酸乙酯萃取，但是萃取效果比较弱，大部分抑菌活性物质仍然留在水相中，石油醚、正丁醇、苯则不能萃取活性物质，因此发酵液中抗菌活性物质可能是一种中高度极性的抗生素。151617181920212223对照24681012PH抑菌圈直径（MM）表4有机溶剂对活性物质的萃取萃取溶剂抑菌圈直径（MM）水相有机相溶剂三氯甲烷175811748乙酸乙酯169813628石油醚203488正丁醇202488苯1988883结果与讨论从以上结果可以看出，我们从微山湖湖底的淤泥中分离得到的

31、放线菌SZ01对真菌物有着很强的抑制作用。提取该菌的16SRDNA，通过测序利用CLUSTAIW软件进行序列分析，再根据放线菌的分类和鉴定和链霉菌鉴定手册,将放线菌SZ01菌株鉴定为链霉菌属STREPTOMYCES。与其最接近的种是STREPTOMYCESERYTHROCHROMOGENES，两者存在相似性，但又有差异性。通过对新鲜发酵液进行加热处理，酸碱处理，紫外光照处理后，从其抑菌活性变化可发现发酵液中抑菌活性物质稳定性良好，这为活性物质的分离与提纯提供了稳定基础。将发酵液经初步处理后，采用有机溶剂进行萃取，结果活性物质在有机溶剂中的分配率较低，可能是一种中高度极性的抗生素。因此还需要进行

32、后期实验，进行制备型HPLC，并对条件进行摸索，以达到结构鉴定的要求。致谢四年的读书生活在这个季节即将划上一个句号，而于我的人生却只是一个逗号，我将面对又一次征程的开始。在论文即将付梓之际，我急切的要把我的敬意和赞美献给我尊敬的导师老师。姚老师深厚的专业修养和平易近人的待人方式让我充满深深的敬意。从论文题目的选定到实验的开展再到论文的写作,姚老师给予我知识上的引导和方法上的教诲，使我的实验和论文能高效顺利的完成，受益匪浅。我还要感谢学院为我提供良好的做毕业设计的环境。实验室李桂芝老师、辅导员孙金玲老师以及我的师姐和同学也给予我很大帮助。我感谢我的父母对我的极大支持，使我能健康快乐的生活与学习。

33、最后，再一次感谢所有在毕业设计中曾经帮助过我的良师益友，谢谢你们。参考文献1阮继生，刘志恒，梁丽糯等。放线菌研究与应用M科学出版社，19902姜怡,唐蜀昆,张玉琴,等放线菌产生的生物活性物质微生物学通报,2007,3411881903CBALACHANDRAN1,VDURAIPANDIYAN1,2,SIGNACIMUTHU1PURIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFPROTEASEENZYMEFROMACTINOMYCETESANDITSCYTOTOXICEFFECTONCANCERCELLLINEA549ASIANPACIFICJOURNALOFTROPICALBIO

34、MEDICINE2012S392S4004HOSHINOY,MUKAIA,YAZAWAKTRANSVALENCINA,ATHIAZOLIDINEZINCCOMPLEXANTIBIOTICPRODUCEDBYACLINICALISOLATEOFNOCARDIATRANSVALENSISITAXONOMY,FERMENTATION,ISOLATIONANDBIOLOGICALACTIVITIESANTIBIOT,2004,57127978025SEUNGSIKCHOYUNHEECHOIJAYARAMSIMKHADAPOONAMMANDERDAJEONGPARKJINCHEOLYOO，ANEWLYI

35、SOLATEDSTREPTOMYCESSPCS392PRODUCINGTHREEANTIMICROBIALCOMPOUNDSBIOPROCESSBIOSYSTENG2012352472546MASKEYRP,LIFC,QINSCHANDRANANIMYCINSACPRODUCTIONOFNOVELANTICANCERANTIBIOTICSFROMAMARINEACTINOMADURASPISOLATEM048BYVARIATIONOFMEDIUMCOMPOSITIONANDGROWTHCONDITIONSANTIBIOT,2003,5676226297顾沛雯宁夏干旱荒漠区苦豆子内生颉顽细菌的筛

36、选及其抑菌物质研究初报J中国植保导刊20098GEBRESELEMAGEBREYOHANNES1,FELEKEMOGES2,SAMUELSAHILE1,NAGAPPANRAJA1ISOLATIONANDCHARACTERIZATIONOFPOTENTIALANTIBIOTICPRODUCINGACTINOMYCETESFROMWATERANDSEDIMENTSOFLAKETANA,ETHIOPIAASIANPACJTROPBIOMED2013364264359BOUDEMAGHA,KITOUNIMISOLATIONANDMOLECULARIDENTIFICATIONOFACTINOMYCETEMICROFLORA,OFSOMESAHARIANSOILSOFSOUTHEASTALGERIABISKRA,ELOUEDANDOURGLASTUDYOFANTIFUNGALACTIVITYOFISOLATEDSTRAINSJOURNALDEMYCOLOGIEMDICALE,200515394410SKAUGUSTINEETALANONPOLYENEANTIFUNGALANTIBIOTICFROMSTREPTOMYCESALBIDOFLAVUSPU23JJBIOSCI2005,302201211