1、实验一 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色
2、的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料小麦面粉；广范pH试纸。2 主要仪器（1）大试管：220cm14（2）烧杯：100mL3（3）三角瓶：100mL1（4）容量瓶：100mL3（5）移液管：1mL3；2mL2；10mL4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光
3、光度计3 试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2molL NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。（3）6mol/L HCl和6mol/L NaOH 。四、操作步骤1 制作葡萄糖标准曲线取7支220cm大试管
4、编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作管 号葡萄糖含量（mg）1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）吸光度值（A540）00021.510.20.21.81.520.40.41.61.530.60.61.41.540.80.81.21.551.01.01.01.561.21.20.81.5将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，用流动水冷却至室温，用蒸馏水补充至20mL（即各加入16.5mL蒸馏水），震荡混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0
5、号管调零点，测出16号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。2 样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液用100mL容量瓶定容，混匀，过滤，滤液作为还原糖提取液，待测。（2）总糖的水解和提取准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6mol/L HCl，置沸水浴中加热水解30min。待三角瓶中的水解液冷却后，用6mol/L NaOH中和（大约10mL
6、左右），用广范pH试纸测试中和到pH=7，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液1 mL，移入另一9mL水的试管中，混匀，稀释10倍 作为总糖待测液。（3）显色和比色取7支220cm大试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，用7号管进行空白调零。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表2 样品还原糖测定管 号还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）吸光度值（A540）查曲线葡萄糖量（mg）72.01.581.01.01.591.01.01.5101.01.01.5111.01.01.5121.01.01.5131.01.01
7、.5五、结果与计算：利用8、9、10号管吸光度值和11、12、13管吸光度值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，分别计算出还原糖和总糖的平均值，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。还原糖（%）=查曲线所得还原糖毫克数稀释倍数100样品毫克数总糖（%）=查曲线所得总糖水解后毫克数稀释倍数0.9100样品毫克数六、注意事项1 试管、烧杯和三角瓶事先要洗净烘干。2 试管要提前标号。3 移液管使用前要润洗。4 移液管要专管专用。5 分光光度计要预热30分钟。6 比色皿要用擦镜纸擦干，尤其是光滑面，更不能用手碰。7 保持环境干净，废液倒在废液缸中，废纸放入垃圾桶中。8 标准曲线制作与样品测定尽量同时进行显色，并使用同一参比溶液调零点和比色。9 用分光光度计比色时，应注意每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍，再用待测液润洗，之后再装待测液。七、思考题13,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?2比色测定时为什么要设计空白管？八、预习题1. 什么是还原性糖2. 高中学过测定还原性糖的方法是什么？其原理和操作又是什么？3. 操作注意：注意事项中要求，用分光光度计比色时，每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍，这是为什么？如果不洗会造成什么影响？
