第十七章甾类激素药物.ppt

1、子学习情境2.2 氢化可的松发酵,发 酵 制 药,任务一 甾类药物,激素：是由内分泌腺体及具有内分泌机能的细胞或组织所分泌的物质（甲状腺、肾上腺、卵巢、睾丸、胰腺等），是动物机体内部自然生成和存在的。,甾类激素药物的分类：1、肾上腺皮质激素2、性激素与促性腺激素3、蛋白同化激素,一、肾上腺皮质激素,肾上腺皮质分泌多种激素。 根据生理功能，肾上腺皮质激素 (简称为皮质激素)被分为三类: 1、糖皮质激素类 2、盐皮质激素类 3、氮皮质素类,1、糖皮质激素类。 为肾上腺皮质的束状带细胞合成、分泌。（1）在生理水平对糖代谢的作用强，对钠、钾等矿物质代谢的作用较弱。（2）在药理治疗剂量下，表现出良好的抗

2、炎、抗过敏、抗毒素、抗休克等作用。,2、盐皮质素类。 为肾上腺皮质的球状带细胞分泌。 在生理水平对矿物质代谢，特别是对钠潴留和钾排泄的作用很强。 在药理治疗剂量下，仅用作肾上腺皮质功能不全的替代疗法，在兽医临床上实用价值不大。3、氮皮质素类。 由肾上腺皮质的网状带分泌，包括雄激素和雌激素。,二、性激素,性激素重要生理功能： 刺激副性器官的发育和成熟，激发副性特征的出现，增进两性生殖细胞的结合和孕育能力，还有调节代谢的作用。分类：（按其生理功能可分为） 雄性激素 雌性激素,雄性激素：雄性激素属于C19类固醇，主要由睾丸和肾上腺皮质所产生，卵巢也有少量合成。睾丸分泌的雄激素主要有3种：睾酮、脱氢异

3、雄酮和雄烯二酮。,雌性激素：包括雌激素和孕激素两类，主要由卵巢合成和分泌，肾上腺皮质和睾丸也能少量合成。雌激素，真正由腺体分泌，有活性的只有3种：17-雌二醇、雌酮和雌三醇。三种激素生理活性相差很大，其相对比活为100 : 10 : 3。孕激素属于C21类固醇，体内真正存在的是孕酮。,三、蛋白同化激素,蛋白同化激素是一类从睾丸酮衍生物中分化出来的药物。特点是性激素的作用大为减弱，蛋白质同化作用仍然保留甚至增强，临床使用比较安全，较少引起男性化症状等不良反应。如17-甲基去氢睾丸素（17-methyldehydro-testosterone，商品名为大力补）。,蛋白同化激素主要作用： 促进蛋白质

4、合成和抑制蛋白质异化； 加速骨组织钙化和生长； 刺激骨髓造血功能，增加红血球量； 促进组织新生和肉芽形成； 降低血胆甾醇。,三、甾体药物的来源,1、化学合成（早期）：成本高，收率低2、微生物转：收率提高，省去这多步化学反应3、天然提取,微生物转化工艺的特点, 可减少化学合成步骤，简化生产流程，缩短生产路线。 如由黄体酮生产炔诺酮，利用微生物转化，可以减少6步工序。, 能提高产物的收率和产品质量，降低成本。不同的菌种都会影响到产品的收率和成本，菌种越优良，反应越向有利的方向进行。采用生物转化，减少了生产步骤，从而也降低了过程损失。 如19-羟基-4-雄烯-3，17-二酮转化为雌酮采用化学法合成需

5、要3步才能完成，产品得率只有15%20%，采用微生物转化法，得率可达到80%以上。,化学合成过程中的化学物质常对产品质量也有影响如：生产去氢可的松和去氢化可的松，过程中要加入SeO2，在产品中常含有少量的Se有毒物质 可进行化学法难以实现的反应。如甾类化合物C-11上的加氧（即羟化）等反应，化学法难以实现，常采用微生物法处理。,微生物转化可供选择的酶的种类较多，为生产过程提供了可能。微生物转化避免和减少了强酸、强碱或化学有毒物质，改善了生产环境。目前一般采用化学合成和微生物转化两种方法相结合的生产工艺。,任务二 微生物转化反应原理,微生物对甾体所转化部位：几乎每个位置都能进行转化。甾体激素药物

6、合成比较重要的转化反应： 一、氧化反应 二、还原反应 三、水解反应等,一、羟化反应,甾体上羟化对化学合成而言是非常困难的，除了C17位上通过化学方法能导入羟基外，其它位置很难导入。通过微生物羟化酶能非常专一地选择某个碳位置上将某空间位置上的氢取代氧化成原来空间构型的羟基。,1C9羟化C9羟化在甾体药物合成中是一个关键中间步骤，涉及到甾体边链的选择性降解，并且是皮质激素合成中一个关键中间体。由于C9位上导入羟基后，容易在C9C10之间引入双键，然后进一步形成C11羟基或导入氟原子。,甾体合成中重要中间体9-羟基-4-雄甾烯-3，17双酮。,9-羟基-3氧化娠烷-4，17双烯-20羧酸的制取,C1

7、1羟化,微生物转化实现甾体C11羟化，不仅解决药物合成，更重要意义是增加皮质激素类化合物活力，使其具有高度抑制炎症效应。C11位羟化为通过微生物转化来寻找更有效新药开创了新途径。,如孕酮的转化中，利用黑根霉在温度不超过320C时成功地实现了C11羟基化反应。,新月弯孢霉（Curvularoa lunata）能将Reichstein S化合物（简称化合物S，Compound S）一步转化成氢化可的松,二、环氧化反应,用微生物转化法在甾体母核上引入环氧基团的反应与微生物羟基化有关。能产生11-羟基化的新月弯孢霉或布氏小克汉银霉都可将17，21-二羟基-4，9（11）-孕甾二烯-3，20-二酮转化成

8、9，11环氧化合物。,三、脱氢反应,当抗炎甾体激素等药物的母核C1，C2位置导入双键后，其抗炎作用会成倍增加。醋酸可的松C1，C2位上导入双键成醋酸脱氢可的松后抗炎作用增强34倍。,R1 = 9F或H；R2 = H，6CH3，6F；R3 = H，16CH3，16OH，16OH,化学法脱C1，C2氢是采用二氧化硒法，由于硒在生产中难以除尽会使产品中带有少量对人体有害的物质采用微生物转化脱氢是甾体抗炎激素药物合成中不可缺少的一步微生物对甾体羟化与脱氢能力是相反的，细菌的脱氢能力比真菌大，特别是棒状杆菌和分枝杆菌活力最大。,四、甾核及边链的选择性降解机理,具有生理活性甾体类药物的基本母核目前都是从高

9、等动植物中获得首先必须有选择性地对其边链进行降解。化学法选择性差，产率低。目前，多采用微生物转化法。,甾体药物的天然资源,薯蓣皂苷元（约占60%）是豆甾醇（约占15%）胆甾醇-谷甾醇,甾核边链的选择性降解的应用,工业上通过生物技术来控制微生物选择性地降解甾体边链以获得：雄甾-4-烯-3，17-双酮，简称4AD；1，4-二烯-雄甾-3，17双酮，简称ADD；3-氧联降胆甾-1，4-二烯-22-酸，简称BDA等。,生物技术控制途径, 通过底物-甾体结构的修饰； 在微生物降解过程中加酶抑制剂； 通过诱变技术获得生化阻断突变菌株。,任务三 甾体激素的生产工艺过程,甾体的微生物转化和一般的氨基酸、抗生素

10、的生产不同发酵的产物不是目的产物，而只是利用微生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物。,生产过程,微生物生长和甾体的转化完全可以分开：一般先进行菌的培养，在菌生长过程中累积甾体转化所需要的酶 然后利用这些酶来改造分子的某一部位。,一、甾体的微生物转化生产流程,甾体微生物转化的两个阶段,第一阶段：微生物生长阶段第二阶段：底物转化阶段,第一阶段：微生物生长阶段,它是将菌种接入斜面培养基或小米培养基培养35d将成熟的菌种细胞或孢子接入摇瓶或种子罐，给予合适的温度、溶氧浓度、pH值等条件培养，使其充分繁殖与生长。培养时间的长短随菌种和环境而异，细菌的生长期1224h，真菌为24

11、72h。,第二阶段：底物转化阶段,一般是在微生物生长的终点，逐渐将甾体的粉末或适当的（有机）溶液加到培养物中，或把成熟细胞分离洗涤，然后悬浮于水或缓冲液中，再将底物加入。,说明：大多数甾体化合物难溶于水，所以常用的方法是先把底物溶于有机溶剂，如丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺（饱和溶解度达10%20%），浓度在2%对微生物无毒性。,微生物转化生产甾体药物的工艺,一般采用二级培养工艺流程如下：,二、甾体微生物转化方式,1、由生长菌体培养物进行的反应是在培养菌体的适当时间（中期或后期），添加基质，一边继续培养，一边进行反应。2、由静态菌体悬液进行的反应是在适当的培养基中，使菌体充分生长发育后，用过滤

12、或离心法进行分离，将收集到的菌体悬浮在水或适当的缓冲液中，再将甾类化合物加入进去，使其反应。,3、混合培养进行反应是将具有1，2脱氢能力和11-羟化能力的微生物并用进行转化反应。（如果两种微生物单独培养，则必须将各过程中的抽提产物转送到下面的工序，人力物力消耗较大。如采用混合培养法，则可省略抽提操作。）,三、影响转化的一般因素,生物转化的关键：选择专属性高的微生物控制适宜的发酵条件,适宜的发酵条件主要包括,（1）搅拌 搅拌可增加传质和传热，可以增加培养基的氧气供给，使氧气均匀分散而提高转化率。（2）通气 可直接增加氧气的供给。有研究表明，溶解氧量对诱导酶产生非常重要。（3）前体半连续的加入 可

13、以降低由于一次大量加入所引起的毒性，也可减少由于发泡所引起前体的损失。,（4）培养基组成 氮源规格影响不太大，水解蛋白比蛋白胨好；糖类和脂肪对11羟化有影响；有些酶反应需要金属离子，例如缺锌不能进行6-羟化，而有些金属离子使酶失活。,（5）温度：微生物的培养都有适宜的温度，若温度太低，微生物生长不良，不能产生足够的酶；若温度过高，又会因酶蛋白变性而使转化反应受阻。,四、产物的分析与分离方法,产物的分析与分离均需要用适当的与水不混溶的溶剂将甾体从培养基中提取出来，最常用的如：氯仿、二氯乙烷、醋酸乙酯和甲基异丁基酮等。溶剂的用量需根据产物在培养基和溶剂中的分配系数而定，提取时要防止乳化。产物的提取

14、液经适当的浓缩，用柱层析或直接用分步结晶的办法可以得到产物。,五、氢化可的松的制备,氢化可的松（Hydrocortisone）又称为皮质醇，化学名称为11，17，21-三羟基孕甾-4-烯-1，20-二酮。其结构式为,氢化可的松的性状,为白色或几乎白色的结晶性粉末，无臭，初无味，随后有持续的苦味，遇光逐渐变质，略溶于乙醇或丙酮，微溶于氯仿，在乙醚中几乎不溶，不溶于水。熔点为212222比旋光度为+1621690（1%乙醇）。,氢化可的松的工业生产,甾体药物的合成基本上是用半合成方法合成的，仅有及少数用全合成制备（如甲基炔诺酮），原因是全合成的工艺路线过长（如可的松需三十余步反应），反应特殊，工艺

15、过程过于繁杂；总收率低，无工业生产的价值。,目前国内外大都采用半合成的工艺路线，即从天然药物中取得含有甾体基本骨架的化合物为原料通过化学合成来制取甾体药物。氢化可的松采用半合成法生产。七步合成制得醋酸化合物S，然后经生物转化制得氢化可的松。,1、反应原理,生物氧化与水解,这一步反应是利用梨头霉菌，引入11-羟基。在产物中，除了氢化可的松（简称体）（）外，还产生11-羟基化合物即表氢可的松（又称为体）（）、少量的其它位置的羟基化合物和未转化的化合物S（）。所以在产品的分离纯化时，以上各种物质必须分离出去。,工艺流程图,2、工艺过程,种子培养：将梨头霉菌接种到土豆斜面培养基，28培养79d，成熟孢

16、子用无菌生理盐水制成孢子悬液后。种子培养的条件：培养基为葡萄糖、玉米浆、硫酸铵等配制，pH为5.86.3，接入孢子悬液后，在通气搅拌下28培养2832h。待培养液菌浓度达到35%以上，无杂菌污染，即可转入发酵罐。,发酵：将玉米浆、酵母膏、硫酸铵、葡萄糖及水投入发酵罐中搅拌，用氢氧化钠溶液调整物料pH值到5.76.3，加入0.03%豆油，灭菌温度120，通入无菌空气，降温至2728，接入犁头霉孢子悬浮液，维持罐压0.6kg/cm2，控制排气量，通气搅拌发酵2832小时。用氢氧化钠溶液调pH值到5.56.0,投入底物氧化：发酵液体积0.15%的莱氏化合物S，氧化48小时后，取样作比色试验检查反应终

17、点。提取：到达终点后滤除菌丝，滤液用树脂吸附，然后用乙醇洗脱，洗脱液经减压浓缩至适量，冷却到010，过滤、干燥得到粗品，熔点195，收率46%左右或用醋酸丁酯多次提取，合并提取液，减压浓缩之适量，冷至010，过滤、干燥得粗品，熔点为195，收率为46%左右,由于生物氧化所用的菌种梨头酶菌的专属性不够理想，成品中除氢化可的松（简称体）外，还生产11-羟基化合物及表氢可的松（简称体），以及少量其它位置的羟基化合物和未转化的化合物S所以在霉菌氧化反应后，用醋酸丁酯提取到它的粗品中，就有以上各种副产物，必须分离提纯。,分离原理：采用混合溶剂法进行分离，利用它们在甲醇-氯乙烷混和溶剂中溶解度的不同（体溶

18、解度较大，体较小）而达到分离目的。分离方法：粗品中主要为体，并混有部分体，必须要分离精制，可以将粗品加入1618倍含8%甲醇的二氯乙烷溶液中，加热回流使全溶，趁热过滤，滤液冷却至050C，冷冻、结晶、过滤、干燥得氢化可的松,精制：用有机溶剂重结晶法进行精制用16倍左右的甲醇或乙醇重结晶，即可以得到精制的氢化可的松，熔点212以上,存在的问题,生物转化反应的转化率较低，投料浓度亦低，氧化的专属性不够理想，是氢化可的松生产中存在的问题，有待于进一步研究。国外在氢化可的松的生产中，用新月弯孢霉在玉米浆培养基中将化合物S直接转化成氢化可的松，11-OH转化率可以达到6575%，大大高于用犁头霉菌的转化率50%。,