没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究-食品质量与安全毕业论文.pdf

1、JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 毕 业 论 文题目： 没食 酸修饰的纳米硒抑菌作用研究专 业： 食品质量与安全二0一六年五月没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究目录摘要.IAbstract. II引言. 11 材料与方法.31.1 实验材料.31.2 仪器设备.31.3 实验方法. 41.3.1 GASe溶胶的制备. 41.3.2 GASe纳米颗粒表面负载的没食子酸浓度的测定.41.3.3 细菌培养基的制备.41.3.4 菌株的活化和菌悬液的制备. 51.3.4 滤纸片法测定GASe溶胶抑菌活性. 51.3.5 带毒平板法测定GASe溶胶抑菌活性.51.3.6

2、 半数抑菌浓度.53 结果与分析.63.1 GASe溶胶的浓度测定.63.2 GASe溶胶抑菌活性.73.4 半数抑菌浓度.113 结论. 12参考文献. 14致谢. 16没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究I摘要本文通过在酸性条件下加热没食子酸(Gallic acid，GA)还原亚硒酸钠制得没食子酸修饰的纳米硒（以下简称“GASe”）。利用高相液相色谱法测定GASe颗粒表面的GA的浓度后，通过滤纸片抑菌法，带毒平板法和比浊法测定其对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌的抑菌效果。结果表明低浓度的GASe对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌都有抑菌效果，随GASe的浓度的增大其抑菌能力随之提高，GASe对金黄色葡

3、萄球菌和大肠杆菌的半数抑菌浓度分别是0.9710-4mol/L和2.07710-3 mol/L。GASe的抑菌效果优于没食子酸单体。说明GASe有望成为一种高活性的纳米类抗菌抑制剂。关键词：GASe 抑菌作用半数抑菌浓度没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究IIAbstractIn this paper, gallic acid modified selenium nanoparticle (“GASe“) was preparedby heating gallic acid (GA) and Na2SeO3 under acidic conditions. The concentration of

4、 GAon GASe was determined by high performance liquid chromatography (HPLC), then usingzone of inhibition assay, radial growth assay and turbidity method to determine theantibacterial effect of GASe on E. coli and S. aureus. The results showed that the lowconcentration of GASe had the antibacterial e

5、ffect on E.coli and S. aureus, and theantibacterial activity of GASe displayed concentration-dependent behavior. 50%inhibitory concentration (IC50) of GASe to E.coli and S. aureus were 2.077 10-3mol/Land 0.97 10-4mol/L, respectively. The antibacterial effect of GASe was better than thatof GA. Theref

6、ore, GASe is expected to be a highly active nano antibacterial agent.Keywords: GASe, Antibacterial effect, 50% inhibitory concentration没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用1引言在我们周围环境中，到处都有各种各样的微生物生存着，绝大多数是对人类无害的微生物，其中有一部分是对人类有害的微生物。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌等是食品、医疗卫生中常见的致病菌。大肠杆菌在食物中超标，不仅会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，还会引起呕吐，腹泻，痢疾等肠道疾病

7、；金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可以起肺炎，心包炎等，甚至败血症，脓毒症等全身感染,严重时会致人死亡。美国疾病防制中心（CDC）指出，金黄色葡萄球菌是目前最难以对付的病菌之一。正由于细菌感染会严重威胁着人类的生命和健康，对这些有害微生物必须采取有效的措施来防止，杀灭或抑制它们。自从抗生素的诞生及广泛使用，许多细菌感染性疾病得到了及时有效的预防、控制和治疗。但是，随着抗生素的大量使用，细菌耐药性菌株越来越多，耐药范围越来越广，甚至出现了一些能对绝大多数抗生素不敏感的超级耐药菌株，这些问题已成为危害人类生存和发展的最大危机。我们国家是世界上抗生素滥用最严重的国家之一，每年约有 8万

8、人死于抗生素泛滥使用导致的不良反应，且这个死亡数字每年都在不断增加，细菌耐药问题比其他国家更加严峻。因此，研制新型非抗生素类抑菌剂已经刻不容缓。非抗生素抗菌剂的研究开始于20世纪80年代初1，近几年，人们研制了许多非抗生素类的抑菌剂，如阳离子聚合物2-7，抗菌肽8-10及具有光热杀菌效果的试剂11,12等等。虽然这些非抗生素药物表现出一定的抑菌作用，但是仍存在一些缺点。例如，阳离子聚合物表现出一定程度的体内溶血，使得其难以作为一个无毒副作用且有效的抗菌物质 13 ，而抗菌肽虽然是天然的抗菌剂，但在生理条件下易被降解。正由于这些问题，寻找安全、有效的非抗生素类抑菌剂已成为医学研究的一个主要目标。

9、没食子酸是一种天然的多酚类化合物，具有抗氧化，抑菌等生物活性14，具有强还原性，但是没食子酸不稳定，易与空气中的氧气反应变成褐色15。硒是一切生物所必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要成分，亚硒酸钠对金黄葡萄球菌有抑菌作用，且随浓度的增大抑菌能力增强16。然而亚硒酸钠毒性大，稳定性差。硒能以多种化学形式存在于生物体内，硒的生物活性和毒性与它的化学形态有关。相对于有机硒和无机硒，红色的零价态纳米硒溶胶具有低毒性，高生物活性和高利用价值17-18。为获取稳定的纳米硒材料，其有效办法之一是加入无毒安全的表面活性剂作为修饰剂。没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用2纳米粒子间存在不同于常规粒子间的纳米作

10、用能。这种纳米粒子作用能是因为纳米粒子的表面缺少邻近配位原子造成的，使纳米粒子具有很高的活性。随着近年来纳米技术的不断发展，纳米材料类抗菌剂的研究也得到一定的进展，而且纳米材料具备吸附病毒细菌、病毒、有机物的能力 19。以纳米粒子为基础的抗菌剂由于其抗菌特性和在人类的细胞中较低的毒性已成为目前国内外的研究热点20。没食子修饰的纳米硒可以克服没食子酸易被氧化和亚硒酸钠不稳定及毒性较大等缺点，因此本论文选用没食子酸修饰的纳米硒溶胶（GASe）作为研究对象，通过滤纸片抑菌法，带毒平板法和比浊法研究其抑菌效果。结果表明GASe溶胶对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果，而且GASe溶胶的抑菌效果也比没食子酸

11、单体好。因此，GASe溶胶有望成为一种有高效、安全的新型抗菌材料。没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用31 材料与方法1.1 实验材料没食子酸 天津市大茂化学试剂厂亚硒酸钠 郑州鸿祥化工有限公司第一分公司盐酸 西陇化工股份有限公司氢氧化钠 天津欧博凯化有限公祠甲醇（色谱纯） 天津永大化学试剂有限公司磷酸 天津永大化学试剂有限公司蛋白栋 北京奥博星生物技术有限公司牛肉膏 北京奥博星生物技术有限公司琼脂粉 上海山浦化工有限公司氯化钠 天津市大茂化学试剂厂1.2 仪器设备SPECORD 200 紫外可见光分光光度计 德国耶拿分析仪器股份公司JD 1000-2电子天平 沈阳龙腾电子有限公司立式压力蒸汽灭菌锅

12、 上海博迅实业有限公司医疗设备厂HH-BII-600电热恒温培养箱 上海跃进医疗机械厂GZX-DH-600-S恒温干燥箱 上海跃进医疗机械厂SW-CJ 系列洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司安捷伦 1260 型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司SYMMETRYC18色谱柱(4.6nm250nm,5m) 美国安捷伦科技公司BCD-5 50WKM 电冰箱 合肥美的荣事达电冰箱有限公司SHA-C 水浴恒温振荡器 金坛市天竟实验仪器厂90-1型恒温磁力搅拌器 上海泸西分析仪器厂有限公司没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用41.3 实验方法1.3.1 GASe溶胶的制备参考已发表的文献进行GASe的合成制备

13、21。用电子天平称取0.18814g没食子酸至250mL烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至容量瓶用蒸馏水定容到100mL，配成0.01mol/L的没食子酸储备液。用电子天平称取0.17294g亚硒酸钠至50mL烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至容量瓶用蒸馏水定容到10mL，配成0.1mol/L的亚硒酸钠储备液。在25mL烧杯中按1：6的浓度加入Na2SeO3与没食子酸，利用盐酸将pH调至3.0后，加热挥干后得到橙红色固相样品。将此样品加蒸馏水溶解，在透析袋中过夜透析除去未反应的没食子酸后，定容于10mL容量瓶中得到GASe溶胶。1.3.2 GASe纳米颗粒表面负载的没食子酸浓度的测定用电子秤称取2mg，4

14、mg，6mg，8mg，1.0mg没食子酸至小烧杯后加入10mL超纯水溶解，得到0.2mg/mL,0.4mg/mL，0.6mg/mL,0.8mg/mL,1.0mg/mL的没食子酸溶液。取2mLGASe溶胶至离心管中，1万转/min离心10分钟后取上清液10L进样。将以上配制好的5种不同浓度的标准品没食子酸溶液分别进样，每种浓度进样3次，每次进样10L，每次进样前经滤膜过滤，测定峰面积。将上清液稀释5倍后再进样。以没食子酸标准溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算出GASe溶胶中没食子酸的浓度，从而计算出GASe的浓度。色谱条件：SYMMETRYC18色谱柱(4.6nm250nm

15、,5m)柱温30，流动相为V(甲醇)：V（0.05%H3 PO4）=15：85溶液，检测波长为273nm，进样量为10L。1.3.3 细菌培养基的制备称取0.5g牛肉膏，1g蛋白胨及0.5g氯化钠溶解定容到100mL，调节pH至7.2（配制固体培养基需加入1.52g琼脂粉），在0.1MPa下高压灭菌20min，备用22。没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用51.3.4 菌株的活化和菌悬液的制备将金黄色葡萄球菌菌种和大肠杆菌菌种接入试管斜面上，在37的恒温培养箱内培养24小时后，置于4冰箱中冷藏备用。将2个配制好的100mL液体培养基经过121高压灭菌20min，在室温下冷却至不烫手。在无菌条件下，用

16、接种环挑取一环置于液体培养基中，于37恒温培养箱中培养24小时作为种子液，不用时置于4冰箱中冷藏备用。1.3.4 滤纸片法测定GASe溶胶抑菌活性选用优质滤纸片直径为6mm的圆形纸片分别装入6个小离心中，其中3个分别加入50L，100L，150L的GASe溶胶，另外三个加入相同量相同浓度的没食子酸溶液，置于62.5的烘箱中烘干。取菌悬液0.2mL转移至之前倒好的平板培养基表面，涂布均匀，制成含菌平板。将烘干的滤纸片贴入含菌平板，每个平板贴3片。在37的恒温培养箱中培养24小时后观察它们的抑菌效果。1.3.5 带毒平板法测定GASe溶胶抑菌活性移取0.2mL金黄色葡萄球菌菌悬液到10个经0.1M

17、Pa高温灭菌20min的培养皿，移取0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mLGASe溶胶到已灭菌的装有14.8mL，14.6mL，14.4mL，14.2mL，14mL 培养基的小锥形瓶中得到 GASe 浓度分别为2.414610-5mol/L,4.829010-5mol/L,7.243410-5mol/L,9.657810-5mol/L ，12.072310-5mol/L的带毒平板。对照组用等量的无菌水代替GASe溶胶，其它不变，迅速摇匀，将培养基倒入培养皿中，贴好标签。放入37的恒温培养箱中培养24小时，观察结果。制备好大肠杆菌的菌悬液后，用相同的方法进行测定GASe溶胶对

18、大肠杆菌的抑菌活性。1.3.6 半数抑菌浓度培养基中含有GASe溶胶的吸光值的测定：分别移取0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mLGASe溶胶到已灭菌的装有液体培养基4.9mL，4.8mL，4.7mL，4.6mL，4.5mL的试管中，在37的振荡器中振荡8小时，在600nm处测定吸光值，以GASe的浓度为横坐标轴，以吸光值为纵坐标轴根据GASe的浓度和吸光值的关系，绘制没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用6标准曲线。半数抑菌浓度的测定：分别移取0.1mL，0.2mLGASe溶胶到已灭菌装有液体培养基4.9ml,4.8ml的试管中,向每个试管移取 0.1mL的金黄葡萄球菌的菌悬液使

19、得GASe浓度分别是3.490210-4mol/L，6.980310-4mol/L。在37的振荡器中培养8小时，观察其浑浊度。分别移取10L，30L，50L，70L，90LGASe溶胶到6个分别装有已灭菌的液体培养基5ml的试管中，向每个试管移取0.1ml的金黄葡萄球菌的菌悬液使得 GASe 浓度分别是 0.348310-4mol/L，1.04110-4mol/L，1.728210-4mol/L，2.410110-4mol/L，3.086710-4mol/L。在37的振荡器中培养8小时。对照组用等量的无菌水代替GAse溶胶，其它不变。观察浑浊度以及在600nm处测定吸光值。此方法平行测定三次。

20、分别移取1.1mL，1.2mL GASe溶胶到已灭菌的3个装有液体培养基4mL的试管中，向每个试管移取 0.1mL 的大肠杆菌的菌悬液使得 GASe 的浓度分别是3.765410-3mol/L，4.030210-3mol/L。在37的振荡器中培养8小时，观察浑浊度。分别移取0.6 mL，0.7 mL，0.8 mL，0.9 mL，1 mLGASe溶胶到已灭菌装有液体培养基4.4 mL，4.3 mL，4.2 mL，4.1 mL，4 mL的试管中，向每个试管移取0.1mL的大肠杆菌的菌悬液使得 GASe 的浓度分别是 2.094110-3mol/L，2.443110-3mol/L，2.792210-

21、3mol/L，3.141210-3mol/L，3.490210-3mol/L。在37的振荡器中培养8小时。对照组用等量的无菌水代替GAse溶胶，其它不变。观察浑浊度以及在600nm处测定吸光值。此方法平行测定三次。GASe溶胶的吸光值记为吸光值1，对照组的吸光值记为吸光值2，含有GASe溶胶和细菌吸光值记为吸光值3。根据公式：抑菌率(%)=吸光值2-(吸光值3-吸光值1)/吸光值2，以GASe浓度为横坐标，以抑菌率为纵坐标，绘制标准曲线，并依据回归方程计算出抑菌率为50%时的浓度即为半数抑菌浓度。3 结果与分析3.1 GASe溶胶的浓度测定采用高效液相色谱法检测GASe纳米粒子表面所负载的没食子酸浓度。的标准曲线图如图1，根据没食子酸的回归方程y=26266x-920.44和GASe溶胶上清液释释5倍后所得峰面积为5522.5计算出GASe溶胶中纳米颗粒表面所负载的没食子酸浓